高效氯氰菊酯暴露下草魚(yú)器官堿性磷酸酶活性的變化

牛景彥 劉占才　王育水　張安世

摘要：研究了暴露在不同濃度高效氯氰菊酯下草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellas）鰓、肝胰臟和腎臟組織中堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的活性變化。試驗(yàn)中高效氯氰菊酯濃度設(shè)5組（0、0.5、1.0、3.0和5.0 μg/L），每組分別于1、5和12 d時(shí)取樣，測(cè)定鰓、肝胰臟和腎臟組織中AKP的活性。結(jié)果表明，0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d時(shí)，鰓中AKP活性顯著下降（P<0.05），肝胰臟和腎臟中的AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05）；暴露5 d時(shí)，鰓和腎臟中AKP活性顯著或極顯著降低（P<0.05，P<0.01），肝胰臟中AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05）；暴露12 d時(shí)，鰓和腎臟中AKP活性極顯著下降（P<0.01），肝胰臟中AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05）。1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，肝胰臟和腎臟中AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05），鰓中AKP活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）；暴露5 d時(shí)，腎臟中AKP活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01），肝胰臟中AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05）；暴露12 d，鰓、肝胰臟和腎臟中AKP活性顯著下降（P<0.01）。3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯顯露1、5和12 d，所測(cè)定組織中AKP活性均顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）。

關(guān)鍵詞：草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellas）；高效氯氰菊酯；堿性磷酸酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q956.86 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）12-2968-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.041

Changes of Alkaline Phosphatase Activity in Organs of Grass Carp Exposed to the Different Beta-cypermethrin Concentration

NIU Jing-yan，LIU Zhan-cai，WANG Yu-shui，ZHANG An-shi

（Department of Technology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454001， Henan，China）

Abstract： To study dynamic changes of alkaline phosphatase activity（AKP） in gill， hepatopancreasand kidney of grass carp（Ctenopharyngodon idellas）exposed to the different Beta-cypermethrin concentration can be helpful to understand of Beta-cypermethrin effect on AKP. In this study，grass carps were randomly divided into five groups including control group and four different Beta-cypermethrin concentration groups （0.5、1.0、3.0 and 5.0 μg/L）.Each was in replication. Biochemistry methods were used to measure AKP activity of gill，hepatopancreas and kidney sampled on day 1，5 and 12，respectively. The results were as follows： contrast to the control，for 0.5 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.05）， but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of gills and kidneys sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but no significant change happened for that of hepatopancreas（P>0.05） on day 5. Finally that of gills and kidneys significantly decreased （P<0.01），and that of hepatopancreas returned to the normal level on day 12.For 1.0 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of serum significantly increased（P<0.01），that of spleens and kidneys were sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas didnt significantly change（P>0.05） on day 5. Finally AKP activity of serum didnt sharply change （P>0.05），that of gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased （P<0.01）on day 12. For 3.0 μg/L and 5.0 μg/L，AKP activity of serum，gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased（P<0.01，P<0.05）.

Key words： Ctenopharyngodon idellas；beta-cypermethrin；activity of alkaline phosphatase

高效氯氰菊酯是一種高效低毒的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥，因其對(duì)哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)的低毒性和對(duì)有害昆蟲(chóng)的高效殺滅性而被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)作物、園藝植物、家庭衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也被作為有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品用來(lái)防治寄生蟲(chóng)和控制有害水生昆蟲(chóng)的過(guò)度增殖[2，3]。由于過(guò)量使用，雨水沖刷使高效氯氰菊酯通過(guò)地表徑流進(jìn)入河道、湖泊等水體，導(dǎo)致非殺滅目標(biāo)的水生無(wú)脊椎動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)等對(duì)神經(jīng)毒素類(lèi)農(nóng)藥非常敏感的生物受到影響[4，5]。研究表明，擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性是哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的1 000倍[6]。目前，關(guān)于高效氯氰菊酯對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響方面的研究報(bào)道很多，主要集中于對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性研究方面[7，8]，對(duì)魚(yú)類(lèi)的代謝酶活性的影響方面也有一定量的報(bào)道[9，10]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）在生物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等物質(zhì)代謝中起著重要的作用，但鮮見(jiàn)高效氯氰菊酯對(duì)魚(yú)類(lèi)AKP活性影響方面的報(bào)道。高效氯氰菊酯在水體中的濃度通常低于魚(yú)類(lèi)的致死濃度，魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期在該環(huán)境中生存，必然會(huì)對(duì)其生理代謝造成影響。草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellas）是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，對(duì)環(huán)境因子的變化較為敏感，本試驗(yàn)研究了低濃度高效氯氰菊酯對(duì)草魚(yú)AKP活性的影響，對(duì)探索高效氯氰菊酯對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性作用機(jī)理有著重要的理論意義，同時(shí)對(duì)評(píng)估魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量及指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展也有著積極的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用草魚(yú)為魚(yú)種場(chǎng)同批、同池養(yǎng)殖的健康草魚(yú)，體重（100±15） g，體長(zhǎng)（15±3） cm。

1.2 適應(yīng)性馴化

將草魚(yú)隨機(jī)分為5組，每組30尾，每組各兩個(gè)平行，放入飼養(yǎng)箱中適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，期間定時(shí)投餌。養(yǎng)殖用水為充氧曝氣的自來(lái)水，每箱放水100 L。光周期12L∶12D；養(yǎng)殖水溫（19±2） ℃；每3 d換水1次，小型增氧機(jī)增氧，各組飼養(yǎng)管理方法相同。

1.3 高效氯氰菊酯暴露處理

采用常規(guī)急性毒性試驗(yàn)方法[11]，測(cè)定了高效氯氰菊酯對(duì)草魚(yú)的96 h半致死濃度（LC50）為6.1 μg/L，設(shè)定高效氯氰菊酯濃度為0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L 4個(gè)處理組（以市售0.4%的高效氯氰菊酯乳液配制）和1個(gè)對(duì)照組，每組2個(gè)平行，正常投喂。試驗(yàn)開(kāi)始后，于1、5、12 d分別從各濃度組隨機(jī)取10尾魚(yú)，用于AKP活性的測(cè)定。

1.4 酶粗提液制備

解剖魚(yú)體，取出鰓、肝胰臟和腎臟組織，按1∶19（m/V）加入0.9%生理鹽水，冰浴勻漿后4 ℃下12 000 r/min離心10 min后取上清液，保存于-20 ℃。

1.5 粗提液蛋白定量

蛋白質(zhì)定量參照Bradford[12]的方法，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白（BSA，購(gòu)于BBI公司）。

1.6 酶活性測(cè)定

AKP活性測(cè)定采用陳清西等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。AKP活性單位定義：28 ℃下每克粗蛋白15 min內(nèi)催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP，購(gòu)于BBI公司）生成1 mg對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶活單位（U/g）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2003統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析和獨(dú)立性t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為P<0.01或P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氰菊酯暴露下草魚(yú)鰓中AKP活性的變化

在不同濃度高效氯氰菊酯下暴露不同時(shí)間，對(duì)照組草魚(yú)鰓暴露1、5、12 d時(shí)AKP活性無(wú)顯著變化（P>0.05），各處理組在不同暴露時(shí)間，AKP活性均顯著或極顯著性下降（P<0.05，P<0.01），并表現(xiàn)出明顯的時(shí)間、劑量效應(yīng)（圖1）。

2.2 高效氯氰菊酯暴露下草魚(yú)肝胰臟中AKP活性的變化

對(duì)照組暴露1、5、12 d時(shí)酶活性之間無(wú)顯著變化（P>0.05）。0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d時(shí)，酶活性無(wú)顯著變化（P>0.05）；1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5 d對(duì)酶活性無(wú)顯著影響（P>0.05），12 d時(shí)酶活性顯著下降（P<0.05）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d時(shí)，酶活性均顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）（圖2）。

2.3 高效氯氰菊酯暴露下草魚(yú)腎臟中AKP活性的變化

對(duì)照組暴露1、5、12 d 時(shí)，腎臟中AKP酶活性之間無(wú)顯著變化（P>0.05）。0.5 μg/L和1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，酶活性無(wú)顯著變化（P>0.05），暴露5、12 d，酶活性顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d，酶活性均極顯著下降（P<0.01） （圖3）。

3 小結(jié)與討論

AKP是動(dòng)物代謝過(guò)程中重要的調(diào)控酶，是一種非特異性的磷酸單酯酶，主要參與生物體對(duì)物質(zhì)的消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)鈣、磷吸收，在維持鈣、磷平衡方面起著重要作用，是魚(yú)類(lèi)賴(lài)以生長(zhǎng)、生存的重要酶類(lèi)之一[12]。在物質(zhì)交換、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)旺盛的器官中，AKP均呈現(xiàn)出高活性。

Clark等[14]研究認(rèn)為菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性極大，是由于魚(yú)類(lèi)的鰓組織極易從外界吸收此類(lèi)物質(zhì)。本試驗(yàn)中，短時(shí)間（1 d）低濃度（0.5 μg/L）暴露下，草魚(yú)鰓中AKP活性顯著下降的結(jié)果印證了這一觀點(diǎn)。王朝暉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)鰓組織能夠造成病理性損傷，破壞鰓組織的離子代謝和滲透平衡，從而影響?hù)~(yú)鰓的生理代謝，本試驗(yàn)各處理組AKP活性均顯著低于對(duì)照的結(jié)果也佐證了這一論點(diǎn)。

有研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體處于氯氰菊酯環(huán)境脅迫初期，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，誘導(dǎo)SOD活性提高使二者達(dá)到一種新的平衡；但隨著氯氰菊酯作用時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，而SOD酶活性被抑制，導(dǎo)致肝組織損傷。本試驗(yàn)中草魚(yú)肝胰臟中AKP活性的變化表明，在低濃度（0.5、1.0 μg/L）、短時(shí)間（1、5 d）暴露下，肝胰臟對(duì)高效氯氰菊酯有一定的耐受性；但隨著高效氯氰菊酯濃度的增加（3.0、5.0 μg/L）和暴露時(shí)間（12 d）的延長(zhǎng)，活性受到顯著或極顯著抑制，這可能與魚(yú)類(lèi)肝胰臟中缺少可分解高效氯氰菊酯的酶有關(guān)，當(dāng)高效氯氰菊酯的脅迫作用超出了肝胰臟的耐受能力后，其代謝功能受到明顯的影響。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯能夠通過(guò)抑制魚(yú)類(lèi)細(xì)胞質(zhì)膜ATP酶的活性，使質(zhì)膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)受到破壞，進(jìn)而影響質(zhì)膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和離子平衡，導(dǎo)致質(zhì)膜逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)離子產(chǎn)生障礙[19]。腎臟作為魚(yú)體調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡的主要器官，在氯氰菊酯的脅迫下，其保鈉排鉀功能減弱，導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)電解質(zhì)平衡失調(diào)，進(jìn)而影響腎臟的生理功能。本研究中氯氰菊酯對(duì)腎臟中AKP活性具有顯著抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量時(shí)間效應(yīng)，也佐證了這一點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)鰓、肝胰臟和腎臟中AKP對(duì)高效氯氰菊酯的敏感性是不同的，這可能與它們不同的生理功能有關(guān)；高效氯氰菊酯的脅迫可以顯著影響鰓、肝胰臟和腎臟的生理代謝，表明高效氯氰菊酯對(duì)草魚(yú)具有較強(qiáng)的毒性。

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