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    941例胚胎玻璃化冷凍保存不同時間復(fù)蘇后臨床結(jié)局分析

    2015-08-10 09:19:32趙靜吳曉云朱玉蓉劉春玲邱慧麒方路
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2015年11期
    關(guān)鍵詞:卵裂玻璃化凍融

    趙靜,吳曉云,朱玉蓉,劉春玲,邱慧麒,方路

    (浙江省湖州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,湖州 313000)

    1983年澳大利亞首例凍融胚胎移植(FET)獲得臨床妊娠[1],1984年世界首例凍融胚胎移植活產(chǎn)嬰兒出生[2]?,F(xiàn)在胚胎凍融技術(shù)在輔助生殖技術(shù)中不可或缺。胚胎凍融技術(shù)不僅提高累計臨床妊娠率,還能降低多胎妊娠[3]與卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發(fā)生率[4]。目前,胚胎凍融技術(shù)主要分為兩類:程序化凍融和玻璃化凍融。1985年美國首例玻 璃 化 凍 融 鼠 胚 成 功[5],1990 年Gordts 等[6]玻 璃化凍融人胚胎,成功獲得妊娠。目前玻璃化凍融方法較程序化凍融胚胎復(fù)蘇率高[7],但由于玻璃化冷凍試劑中的二甲基亞砜(DMSO)對胚胎有一定的毒性,胚胎長期保存后其安全性仍需要進(jìn)一步研究。本文對我中心941 例玻璃化胚胎解凍周期進(jìn)行回顧,分析玻璃化胚胎保存時間對解凍后胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局的影響。

    材料與方法

    一、研究對象

    回顧性分析我中心2011年3 月至2014 年10月941例玻璃化冷凍胚胎解凍周期的患者資料。女方年齡20~40歲,平均(30.23±4.00)歲,不孕原因主要為男方因素與女方輸卵管因素,排除患子宮內(nèi)膜異位癥與干擾胚胎著床疾病的患者。本研究僅納入促排方案為常規(guī)長方案與超長方案所獲的玻璃化冷凍胚胎,排除行FET 三個周期以上患者。其中IVF周期762 例,ICSI周期179 例,均采用開放式玻璃化載桿冷凍第3天胚胎。

    二、研究方法

    1.分組:根據(jù)胚胎玻璃化冷凍保存時間不同將941 例FET 周 期 分 為3 組:1~<9 個 月 組(749例)、9~<16 個月組(144 例)與≥16 個月組(48例,冷凍時間最長為38.4個月)。

    2.胚胎冷凍:根據(jù)Edwards評分方法[8]對第3天胚胎進(jìn)行評估,分裂胚形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)分為4級。Ⅰ級:卵裂球大小均等,透亮且無碎片;Ⅱ級:卵裂球大小不均,碎片<10%;Ⅲ級:卵裂球大小不均,碎片在10%~50%之間;Ⅳ級:卵裂球大小不均,碎片>50%。Ⅰ~Ⅲ級定義為優(yōu)質(zhì)胚胎,選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍。冷凍前將冷凍試劑盒(JY公司,加拿大)置常溫預(yù)溫30 min。根據(jù)冷凍試劑盒說明書將胚胎移至冷凍試劑V1后,胚胎迅速皺縮,之后逐漸恢復(fù),待胚胎膨脹至最飽滿時(約5min),將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍試劑V2,放置30s 后,將胚胎以最小液滴裝入載桿(JY 公司,加拿大)并浸沒于液氮1min。

    3.胚胎復(fù)蘇:解凍前將解凍試劑盒(JY 公司,加拿大)置常溫預(yù)溫30min。根據(jù)解凍試劑盒說明將冷凍胚胎依次經(jīng)過試劑T1、T2、T3 清洗各2min、3min、3min,每次胚胎轉(zhuǎn)移均應(yīng)充分洗凈,轉(zhuǎn)入試劑T4后將培養(yǎng)皿放于37℃熱臺,3min后將胚胎轉(zhuǎn)移至G2培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中洗凈,最后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)G2 液。復(fù)蘇胚胎在37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后用于移植。

    胚胎復(fù)蘇后無卵裂球融解為完整胚胎存活,1~2個卵裂球融解為基本完整胚胎存活,一半以上卵裂球融解定義為胚胎死亡;胚胎存在率=解凍后胚胎存在數(shù)/胚胎冷凍數(shù);復(fù)蘇存活率=復(fù)蘇存活胚胎數(shù)/解凍后胚胎存在數(shù);完整胚胎存活率=完整胚胎數(shù)/解凍后胚胎存在數(shù);基本完整胚胎率=基本完整胚胎數(shù)/解凍后胚胎存在數(shù)。

    4.移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備:(1)自然周期,適用月經(jīng)周期正常、排卵規(guī)律并且內(nèi)膜形態(tài)較好患者。月經(jīng)周期9~10d陰道B超監(jiān)測卵泡大小與子宮內(nèi)膜發(fā)育情況,同時監(jiān)測血E2、LH 及孕酮(P)值,排卵后3~4d且內(nèi)膜厚度≥8mm 進(jìn)行復(fù)蘇胚胎移植。(2)人工周期,適用月經(jīng)周期不正常、排卵不規(guī)律等患者。月經(jīng)周期第3 天口服雌激素(補(bǔ)佳樂,拜耳,德國)6mg/d連續(xù)服用7d,8mg/d連續(xù)服用7d,14d時B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度與形態(tài),并檢測E2水平。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8mm 時,E2>750pmol/L時,肌肉注射黃體酮(60mg/d,浙江仙琚)進(jìn)行黃體支持,第3天復(fù)蘇胚胎并移植。

    5.胚胎移植與妊娠檢測:移植前將胚胎轉(zhuǎn)移至移植膠(Vitrolife,瑞典)中,三段法將胚胎移至移植管(COOK,美國)中段,腹部B超監(jiān)測下將胚胎置于距宮底1~1.5cm 處。移植后14d檢測HCG 確定妊娠情況,HCG 陽性為生化妊娠,生化妊娠患者于胚胎移植4 周后進(jìn)行B 超檢查,有孕囊者為臨床妊娠。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、一般資料

    3組患者冷凍時間分別為1~<9個月、9~<16個月與≥16個月,女方平均年齡分別為(30.20±3.95)歲、(30.24±4.29)歲與(30.94±3.78)歲,3組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);IVF比例分別為81.04%、80.56%與81.25%,授精方式無顯著性差異(P>0.05);3 組患者的平均解凍胚胎個數(shù)(玻璃化冷凍胚胎解凍數(shù))和平均移植胚胎個數(shù)(玻璃化冷凍胚胎移植數(shù))相比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

    二、各組復(fù)蘇胚胎質(zhì)量比較

    3組患者的胚胎存在率、基本完整胚胎率相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);3組復(fù)蘇后存活率分別為98.22%、98.06%與96.33%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);≥16個月組完整胚胎存活率高達(dá)88.07%,但與其他兩組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    三、復(fù)蘇胚胎移植后妊娠結(jié)局比較

    1~<9 個月組移植749 例,其中生化妊娠466例(62.22%),臨 床 妊 娠440 例(58.74%);9~<16 個 月 組 移 植144 例,生 化 妊 娠78 例(54.17%),臨床妊娠71例(49.31%);≥16個月組移植48 例,生 化 妊 娠26 例(54.17%),臨 床 妊 娠25例(52.08%)。3組間生化妊娠率與臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)。3組種植率和異位妊娠率分別相比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 3組患者一般資料比較(±s)]

    表1 3組患者一般資料比較(±s)]

    組 別 周期數(shù) 女方年齡(歲) IVF比例(%)平均解凍胚胎個數(shù) 平均移植胚胎個數(shù)1~<9個月749 30.20±3.95 81.04 2.17±0.58 1.97±0.16 9~<16個月 144 30.24±4.29 80.56 2.16±0.59 1.97±0.18≥16個月48 30.94±3.78 81.25 2.29±0.46 1.96±0.29

    表2 玻璃化冷凍保存不同時間復(fù)蘇胚胎質(zhì)量比較(%)

    表3 玻璃化冷凍保存不同時間胚胎復(fù)蘇移植后妊娠結(jié)局比較(%)

    討 論

    胚胎冷凍技術(shù)在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用。胚胎冷凍技術(shù)不僅有助于預(yù)防卵巢過激反應(yīng),為臨床選擇促排卵方案提供保障,也能夠提高患者累計臨床妊娠率。近年玻璃化凍融得到廣泛的應(yīng)用。1998年Mukaida等[9]成功使用玻璃化冷凍方法冷凍鼠胚與人胚。與程序化凍融相比,玻璃化凍融因操作簡單、費(fèi)用低、復(fù)蘇存活率高以及成功率較高等優(yōu)越性已逐漸取代程序化冷凍[10-11]。

    玻璃化冷凍試劑采用滲透性冷凍保護(hù)劑,如DMSO 與乙二醇(EG),這些小分子物質(zhì)能夠快速穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),降低細(xì)胞內(nèi)外液體之間滲透壓,減緩細(xì)胞內(nèi)水分滲出從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。高濃度DMSO 對細(xì)胞有一定的毒性,可能是由于DMSO 能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆性結(jié)合[12]。但是冷凍保存胚胎于-196℃液氮中對胚胎影響尚不可知,因此對玻璃化冷凍胚胎長期保存后胚胎質(zhì)量與解凍后妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析是必要的。

    現(xiàn)在對于胚胎冷凍保存時間是否影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局觀點不一。1987 年Testart等[13]指出冷凍胚胎保存時間在1~2個月內(nèi)解凍移植有助于提高妊娠率,但認(rèn)為胚胎長時間保存于液氮中會降低胚胎存活率。而Riggs等[14]在2010年對11 768枚冷凍合子與胚胎回顧性分析發(fā)現(xiàn),隨著冷凍時間的延長,無論是普通IVF 周期還是供卵周期,臨床妊娠率、流產(chǎn)率、胚胎種植率以及活產(chǎn)率均無顯著性差異,但是解凍后妊娠結(jié)局與取卵時患者年齡、解凍后胚胎存活率以及移植胚胎數(shù)均有關(guān)。2011年趙慶紅等[15]將胚胎保存時間分為3組,發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍胚胎保存時間對復(fù)蘇胚胎質(zhì)量與FET 結(jié)局沒有影響。2013年Aflatoonian等[16]根據(jù)玻璃化冷凍胚胎保存時間不同,將651枚胚胎分為5組,發(fā)現(xiàn)5組患者胚胎種植率與臨床妊娠率均無明顯差異,但認(rèn)為仍需對長期保存胚胎種植后出生嬰兒進(jìn)一步跟蹤研究。

    2011年Dowling-Lacey等[17]報道冷凍保存時間長達(dá)20年的合子獲得新生兒1例。1990年34歲患者成功妊娠后捐獻(xiàn)了剩余5枚冷凍合子,20年后42歲受體患者因卵巢反應(yīng)低下接收捐贈:5枚合子解凍后存活2枚,培養(yǎng)至第2天移植到受者體內(nèi)并成功獲得一健康男嬰。這是目前人胚胎保存最長并獲得成功的案例。另外2011 年Lavara等[18]報道玻璃化冷凍保存兔胚,于液氮中保存15年后,存活率、種植率以及活產(chǎn)率均未降低。2013年Wirleitner等[19]對1 077枚解凍囊胚進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍囊胚6 年其解凍存活率與妊娠結(jié)局沒有降低,出生嬰兒畸形率也沒有顯著上升。上述研究表明冷凍保存不降低合子、分裂胚或者囊胚的質(zhì)量。Wong等[20]認(rèn)識到胚胎冷凍技術(shù)發(fā)展迅速,F(xiàn)ET 成功率與新鮮胚胎移植成功率接近,因而提出全胚胎冷凍策略,他認(rèn)為全胚胎冷凍可以完全避免卵巢過激反應(yīng)。

    胚胎冷凍在ART 中具有重要的地位,因此有必要尋找影響玻璃化凍融胚胎質(zhì)量的因素。趙慶紅等[21]分析了323個玻璃化胚胎凍融周期,發(fā)現(xiàn)隨著患者年齡增加,妊娠率明顯降低??赡芘c高齡婦女卵巢儲備功能降低、子宮內(nèi)膜容受性差有關(guān)。另外胚胎復(fù)蘇存活比例也是重要影響因素,解凍胚胎完全存活組種植率與臨床妊娠率均顯著高于非完全存活組。Cercas等[22]提出玻璃化冷凍胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)1d,有胚胎發(fā)育成桑椹胚或者囊胚的患者比仍處于分裂期胚胎患者妊娠率高。胚胎繼續(xù)發(fā)育潛能也是影響胚胎妊娠結(jié)局的重要因素。

    由于玻璃化法冷凍采用高濃度的冷凍保護(hù)劑,這些冷凍劑對胚胎的毒性作用是否會對子代造成不良影響,目前尚無定論。有必要對胚胎冷凍安全性進(jìn)一步研究。Yao等[23]發(fā)現(xiàn)綿羊胚胎保存0.5 年后,胚胎解凍后綿羊活產(chǎn)率、后代死亡率以及出生時體重較冷凍保存7.5d者無統(tǒng)計學(xué)差異。

    本文研究結(jié)果顯示胚胎玻璃化冷凍保存時間延長未降低胚胎復(fù)蘇存活率與完整胚胎率,同時,F(xiàn)ET周期生化妊娠率、臨床妊娠率以及胚胎種植率未隨胚胎保存時間延長而降低。提高解凍胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局,不僅需要獲得優(yōu)質(zhì)胚胎,還要與患者溝通,盡早移植。玻璃化凍融胚胎移植技術(shù)不僅安全可靠,還能降低患者費(fèi)用,預(yù)防OHSS,提高累計臨床妊娠率,值得臨床上推廣應(yīng)用。

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