DNS法測定甘蔗渣中還原糖含量

彥繁鶴，周金梅，吳如春

（廣西民族大學化學與化工學院，廣西南寧530008）

DNS法測定甘蔗渣中還原糖含量

彥繁鶴，周金梅，吳如春*

（廣西民族大學化學與化工學院，廣西南寧530008）

采用DNS法測定甲酸預處理甘蔗渣過程中還原糖含量，對影響DNS法的因素進行了比較研究，確定了最佳的檢測條件：檢測波長494 nm，顯色劑用量1.5 mL，顯色時間5 min，在優(yōu)化的檢測條件下DNS法能獲得良好的檢測結(jié)果。

蔗渣；DNS；還原糖；測定

甘蔗渣是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，每生產(chǎn)1 t的蔗糖會產(chǎn)生約1 t的甘蔗渣。甘蔗渣主要由纖維素、半纖維素木質(zhì)素等組成[1-3]。甘蔗渣在利用過程中必須去除木質(zhì)素，在采用甲酸預處理甘蔗渣過程纖維素和半纖維素會產(chǎn)生部分降解生成還原糖，還原糖含量的多少與纖維素、半纖維素的降解程度密切相關(guān)，也就關(guān)系到纖維素、半纖維素的可利用率，因此還原糖的測定對甘蔗渣的綜合利用研究具有十分重要的意義。還原糖含量測定有多種方法，如旋光法、氣相色譜法、液相色譜法、分光光度法等[4]。其中旋光法測定準確性較差，氣相色譜法和液相色譜法成本高，測量過程比較復雜；相對而言，3，5-二硝基水楊酸法（DNS）[5]具有準確性較高，重現(xiàn)性較好，適合大批量樣品的測定等特點而被廣泛使用；在還原糖含量測定中，鮮有見到有用DNS法測定甘蔗渣中的還原糖，而DNS法過程中的諸多因素如吸收光譜、顯色劑用量、顯色劑時間[6-7]等均對測定結(jié)果的準確性有直接影響，為了能準確測定甘蔗渣中還原糖的含量，我們對用DNS法測定甘蔗渣中還原糖的含量的反應(yīng)條件進行了一系列的實驗，試圖摸索出最佳的檢測條件以保證實驗結(jié)果的精準度，以期建立一準確、可靠的的分析方法為甘蔗渣的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗渣來自廣西崇左糖廠，經(jīng)烘至恒重，粉碎備用。

1.1.1 樣品還原糖的制備

稱取一定量甘蔗渣置于三口燒瓶中，按一定比例加入甲酸水溶液后將燒瓶置于電熱套中，加熱至沸點反應(yīng)一定時間后停止加熱，過濾獲取黑液。黑液經(jīng)過蒸餾，加水抽濾等方法去除木質(zhì)素后所得液體部分即為含一定還原糖的待測樣品。

1.1.2 主要儀器

AR1140電子天平：美國奧豪斯；ZNCL-T電熱套：鞏義市科瑞儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TU-1810PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；101-S型鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；KQ 3200DB型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 測定所需試劑

3，5-二硝基水楊酸法（DNS），1 mg/mL葡萄糖標準液。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定原理

DNS法即3，5-二硝基水楊酸比色法的英文簡稱，其檢測原理是根據(jù)3，5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物—3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比，通過分光光度計測定溶液的吸光度值可以定量測定還原糖的含量。

圖1 DNS法檢測原理Fig.1 DNS method detection principle

1.2.2 DNS法測定條件的研究

1.2.2.1 DNS法測定測定波長的確定

（空兩格）分別取葡萄糖標準液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL試管中，取1、3、5、7號4個試管（1號為空白樣），分別準確加入DNS試劑1.5 mL，用蒸餾水補至2 mL，于沸水浴中加熱5 min后流水冷卻，定容，超聲3 min，在確定波長下測定溶液的吸光度于波長段190 nm～900 nm處進行掃描，結(jié)果空白樣品和對照品在均在494 nm有最大吸收，故確定494 nm為檢測時所用波長。

1.2.2.2 顯色時間的確定

取葡萄糖標準液0.5 mL及蒸餾水1.5 mL于系列25 mL試管中，分別加入1.5 mL DNS試劑，置沸水浴中加熱、反應(yīng)不同時間后取出，流水冷卻，定容，超聲3 min，測定不同時間的吸光度。相同條件下測定空白溶液。

1.2.2.3 DNS試劑用量的確定

在準確加入0.5 mL葡萄糖標準溶液的系列試管中，分別加不同量的DNS試劑，沸水浴加熱5 min，流水冷卻，定容，超聲3 min，相同條件下測定空白溶液。1.2.3葡萄糖標準曲線的制作

分別取葡萄糖標準液（1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL試管中，分別準確加入DNS試劑1.5 mL，用蒸餾水補至2 mL，沸水浴加熱5 min，流水冷卻，定容，超聲3min，在1.4.2.1確定波長下測定吸光度。

1.2.4 樣品測定

樣品按照1.1.1確定的條件處理后，測定吸光度，在葡萄糖標準曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)。按下式1計算樣品中還原糖的百分含量。

1.2.5 回收率實驗

5份樣品待測液中各取0.1 mL置于5個25 mL試管中，再按順序加入1 mg/mL葡萄糖標準液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，混勻，定容至25 mL，測定吸光度，計算回收率。

1.2.6 精密度試驗

同時取5份樣品待測液各0.1 mL測定吸光度，并計算標準偏差RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色時間對測定結(jié)果的影響

顯色時間對測定結(jié)果的影響見圖2。

圖2 顯色時間對測定結(jié)果的影響Fig.2 The influence of chromogenic time on thedetermination results

由圖2可以看出，隨著沸水浴加熱時間的延長，吸光度變大，但在3 min～11 min內(nèi)，吸光度都較穩(wěn)定。故水浴加熱時間在5 min即可。這一結(jié)論與孫偉偉等[8]結(jié)果一致。

2.2 DNS試劑用量及放置時間的確定

DNS試劑用量與待測液中還原糖的含量密切相關(guān)。DNS試劑用量及放置時間的確定見圖3。

圖3 試劑用量及放置時間對吸光度的影響Fig.3 Reagent dosage and time on the influence of the absorbance

由圖3可見，隨著DNS試劑用量的增加，溶液的吸光度隨之增加，但DNS試劑用量增加至1.5 mL后，其吸光度數(shù)值基本上與放置時間無關(guān)。因此，選擇DNS試劑的最佳用量為1.5 mL。

2.3 標準曲線

葡萄糖的標準曲線見圖4。

圖4 葡萄糖的標準曲線Fig.4 The standard curve of glucose

2.4 回收率實驗

實驗結(jié)果如表1所示，回收率滿足分析要求。

表1 回收率實驗結(jié)果Table 1The recovery experiment results

2.5 精密度實驗

實驗結(jié)果如表2所示，該分析方法有較高的精密度。

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2The precision of the result of the experiment

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，在堿性溶液中3，5-二硝基水楊酸被還原糖還原生成的氨基化合物在494 nm波長下具有最大吸收。采用DNS法測定甘蔗渣中還原糖的最佳條件為：檢測波長494 nm，DNS試劑用量1.5 mL，沸水浴中保持5 min。本法的回收率與精密度良好，操作方便，可以應(yīng)用于甘蔗渣中還原糖的測定。

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[2]張木明,徐振林,張興秀,等.預處理對稻草秸稈纖維素酶解產(chǎn)糖及纖維素木質(zhì)素含量的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2006(3):4-6

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[4]王俊剛,張淑珍,楊本鵬,等.3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定甘蔗莖節(jié)總糖和還原糖的含量[J].甘蔗糖業(yè),2008(5):45-48

[5]韓魯佳,閆巧娟,劉向陽,等.中國農(nóng)作物秸稈資源及其利用現(xiàn)狀[J].農(nóng)業(yè)工程學報,2002,18(3):87-91

[6]陳勇,陶德欣,魯黎明,等.DNS法測定煙草還原糖條件的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2011,39(5):393-395

[7]李衛(wèi)彬,陽文輝,黃鎖義,等.DNS法測定黃柏中總糖的含量[J].右江民族醫(yī)學院學報,2008,30(1):13-14

[8]孫偉偉,曹偉強,王靜,等.DNS法測定玉米秸稈中總糖[J].食品研究與開發(fā),2006,27(6):120-123

Colorimetric Determination of Reducing Sugar by Methanoic Acid Pretreatment Bagasse with 3，5-Dinitrosalicylic Acid

YAN Fan-he，ZHOU Jin-mei，WU Ru-chun*
（Department of Chemistry and Ecoengineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530008，Guangxi，China）

Based on DNS method，we have determined the reducing sugars content from bagasse which was pretreated with formic acid.The factors influencing on the DNS method are studied，and the optimum condition of detection was also determined：wavelength 494 nm；chromogenic agent 1.5 mL；chromogenic time 5 min，Under the optimum conditions，good results can be obtained based on DNS method.

bagasse；3，5-Dinitrosalicylic acid colormitry；reducing sugar；determination

2013-12-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.031

國家自然基金項目（21306028）；廣西民族大學引進人才科研啟動項目（2011QD023）

彥繁鶴（1985—），女（漢），在讀碩士，研究方向：生物化工。

*通信作者：吳如春（1973—），女（漢），教授，研究生導師，研究方向：生物化工。