培養(yǎng)液中不同蛋白添加物對IVF／ICSI-ET 植入前胚胎發(fā)育及臨床妊娠結(jié)局的影響

唐寧，孔令北，劉海萍，王建業(yè)＊

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，濟南 250031；2.山東濟寧兗州區(qū)第一中學生物組，濟寧 272100）

在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中，獲得高質(zhì)量、發(fā)育潛能良好的胚胎是得到好的臨床妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。一直以來，認為培養(yǎng)液的質(zhì)量是體外胚胎培養(yǎng)的關(guān)鍵，這包括培養(yǎng)液的溫度、滲透壓、pH 值以及培養(yǎng)液的組成成分等［1-8］。而在培養(yǎng)液的組成成分中，蛋白添加物必不可少。血清替代補充成分（SSS）和人血清白蛋白（HSA）是兩種非常常用的蛋白添加物，有必要對其在體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）中的作用作進一步地探討。

一、材料與方法

1.研究對象：回顧性分析2013年5月1日至2013年9 月30 日 及2014 年5 月1 日 至2014 年9月30 日在本中心行IVF／ICSI-ET 的患者。所有納入患者均使用短方案超排卵，女方不孕因素為輸卵管因素，移植日為取卵后第3天。所有患者均施行新鮮胚胎移植。

2.分組：本中心所有胚胎培養(yǎng)均使用瑞典Vitrolife序貫培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)液蛋白添加物的不同，將患者分為HSA 組（以10%HSA 作為胚胎培養(yǎng)液添加物）和SSS組（以20%SSS作為胚胎培養(yǎng)液添加物），其中2013年的患者為HSA 組，而2014年的患者為SSS組。

3.診療方法回顧：使用本中心已建立的方法［9］。具體為：經(jīng)本中心常規(guī)方法超排卵后，當主導卵泡直徑達18 mm 時，肌肉注射HCG 5 000～10 000U；HCG 注射后36～40h，于超聲引導下經(jīng)陰道取卵；取卵后3～5h行IVF 或4～6h行ICSI授精，授精后18～20h觀察受精情況；授精后68～70h觀察胚胎卵裂球的數(shù)目和碎片多少，并以此為根據(jù)判定胚胎的級別，分為Ⅰ級胚胎（卵裂球大小均勻，胞漿碎片＜10%）、Ⅱ級胚胎（卵裂球大小略不均勻，胞漿碎片＜15%）、Ⅲ級胚胎（胞漿碎片＜50%，卵裂球的情況類似于Ⅱ級胚胎）和Ⅳ級胚胎（胞漿碎片＞50%）。胚胎達6 細胞以上，Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

取卵后第3 天進行ET，移植時優(yōu)先選用優(yōu)質(zhì)胚胎。移植胚胎的數(shù)目嚴格按照國家標準，即：患者年齡＜35歲，移植2個胚胎；患者年齡≥35 歲或患者處于2個以上（包括2個）移植周期，移植3個胚胎。移植后給予黃體酮支持黃體功能，2周后測尿HCG，陽性者為生化妊娠，5周后B超檢查胚囊數(shù)，見孕囊及胚芽即診斷為臨床妊娠。

4.觀察指標：將行IVF和ICSI的患者分別進行患者基本情況、胚胎發(fā)育和妊娠情況的比較，統(tǒng)計學分析其差異?；颊叩幕厩闆r包括年齡、不孕年限、平均促性腺激素（Gn）量、Gn使用天數(shù)、獲卵數(shù)；胚胎發(fā)育情況包括受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)率、移植胚胎數(shù)和胚胎冷凍率；妊娠情況包括妊娠率和著床率。

IVF的受精率＝（雙原核胚胎數(shù)＋單原核胚胎數(shù)＋多原核胚胎數(shù)）／總?cè)÷褦?shù)×100%；ICSI的受精率＝（雙原核胚胎數(shù)＋單原核胚胎數(shù)＋多原核胚胎數(shù)）／MⅡ期卵母細胞數(shù)×100%；卵裂率＝卵裂胚胎數(shù)／（雙原核胚胎數(shù)＋單原核胚胎數(shù)＋多原核胚胎數(shù)）×100%；優(yōu)胚率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／卵裂胚胎數(shù)×100%；妊娠率＝臨床妊娠數(shù)／患者總?cè)藬?shù)×100%；著床率＝孕囊或胚芽數(shù)／移植胚胎總數(shù)×100%；胚胎冷凍率＝移植后有冷凍胚胎的病例數(shù)／總例數(shù)×100%。

5.統(tǒng)計方法：使用SPSS 10.0進行分析。定量資料結(jié)果以平均值±標準誤表示；定量資料使用成組設(shè)計的t檢驗，定性資料使用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.行IVF-ET 的患者：SSS 組與HSA 組的患者年齡、不孕年限、平均Gn量、使用天數(shù)和獲卵數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）；兩組患者的受精率、卵裂率、移植胚胎數(shù)、妊娠率和著床率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而SSS組的胚胎冷凍率、優(yōu)胚率均顯著高于HSA 組（P＜0.05）（表2）。SSS可促進植入前胚胎的發(fā)育但不能改善IVF-ET 臨床妊娠結(jié)局。

2.行ICSI-ET的患者：SSS組與HSA 組在不孕年限、平均Gn量和使用天數(shù)上無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但SSS組患者年齡顯著高于HSA 組（P＜0.05），且SSS組的獲卵數(shù)顯著低于HSA 組（P＜0.05）（表3）；兩組患者受精率、卵裂率和妊娠率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但SSS組的冷凍率和優(yōu)胚率均顯著高于HSA 組（P＜0.05），而SSS組著床率顯著低于HSA 組（P＜0.05）（表4）。SSS能促進ICSI后胚胎早期發(fā)育，提高卵母細胞的利用率。

3.年齡對行ICSI-ET 的患者妊娠情況的影響：由于SSS組患者的年齡高于HSA 組、著床率低于HSA 組，為進一步探討年齡對妊娠結(jié)局的影響，接受ICSI的患者按年齡分成＜35 歲組和≥35歲組，對不同年齡組中SSS和HSA 對妊娠結(jié)局的影響分別進行分析。結(jié)果顯示，無論在＜35歲 組 中，還 是 在≥35 歲 組 中，SSS 和HSA 對妊娠率和著床率的影響均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表5）。

表1 IVF患者基本情況（±s）

表1 IVF患者基本情況（±s）

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天數(shù)（d） 獲卵數(shù)（個）12 9.89±0.27 SSS組 622 31.65±0.21 4.06±0.11 27.91±0.42 9.83±0.HSA 組 467 31.83±0.24 4.15±0.14 27.34±0.53 9.66±0.11 9.62±0.24

表2 IVF患者胚胎發(fā)育及妊娠情況［（±s），%］）

表2 IVF患者胚胎發(fā)育及妊娠情況［（±s），%］）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數(shù) 胚胎總數(shù)（個）受精率 卵裂率 優(yōu)胚率 移植胚胎數(shù)（個）著床率 妊娠率 胚胎冷凍率.66 68.74 SSS組 622 5 983 79.13 94.38 63.20＊ 1.98±0.036 34.34 53.72 76.58 HSA 組 467 4 618 79.78 94.13 50.39 2.01±0.034 33.16 49＊

表3 ICSI患者基本情況（±s）

表3 ICSI患者基本情況（±s）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數(shù) 年齡（歲） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天數(shù)（d） 獲卵數(shù)（個）14 9.35±0.31 SSS組 457 32.76±0.28＊ 4.46±0.17 27.20±0.51 9.26±0.13 8.28±0.26 HSA 組 286 30.03±0.31 4.51±0.20 28.01±0.58 9.53±0.＊

表4 ICSI患者胚胎發(fā)育及妊娠情況［（±s），%］）

表4 ICSI患者胚胎發(fā)育及妊娠情況［（±s），%］）

注：與HSA 組比較，＊P＜0.05

組別 例數(shù) 胚胎總數(shù)（個）受精率 卵裂率 優(yōu)胚率 移植胚胎數(shù)（個）著床率 妊娠率 胚胎冷凍率18 60.09 SSS組 457 3 784 86.05 95.92 61.80＊ 2.00±0.04＊24.29＊ 41.95 68.29 HSA 組 286 2 674 84.79 95.07 51.12 2.19±0.04 29.23 46.＊

表5 兩種蛋白添加物對不同年齡組ISCI患者妊娠情況的影響（%）

三、討論

胚胎的生長環(huán)境，尤其是培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)液一直是IVF-ET 的關(guān)鍵。一旦出現(xiàn)不理想的臨床妊娠結(jié)局，輔助生殖工作者首先考慮的就是胚胎培養(yǎng)液是否出了問題或者培養(yǎng)環(huán)境是否有變化。一直以來，研究者都在不停地研究如何改進現(xiàn)有的培養(yǎng)液，以期獲得更好的、有發(fā)育潛能的胚胎，進而改善臨床妊娠結(jié)局。胚胎培養(yǎng)液中蛋白添加物的加入有助于獲得更好的優(yōu)質(zhì)胚胎。培養(yǎng)液中最早使用的蛋白添加物是母源性的血清蛋白，而后發(fā)展為人血清白蛋白（HSA 和Buminate），再后人們開始使用蛋白替代物（包 括SSS、SPS、LGPS 等）?，F(xiàn) 在，HSA 和SSS是各生殖中心胚胎培養(yǎng)最常用的蛋白添加物。

1995年有研究顯示，和HSA 相比，添加了SSS的胚胎培養(yǎng)液在提高受精率和胚胎形態(tài)學質(zhì)量方面并沒有優(yōu)勢［10］，但第2年對小鼠的研究則證實，SSS能促進小鼠胚胎生長，具有和血清同樣的效果［11］，而同年的臨床回顧性分析研究則表明：相對于母源血清和人血漿蛋白粉（Plasmanate），SSS 能提高胚胎的種植率，從而獲得更好的臨床妊娠結(jié)局［12］。2009年，有研究者證明，與單純添加HSA 相比，SSS和HSA 的共同添加能提高胚胎的植入率并能提高最終的活產(chǎn)率［13］。與前述研究相一致的是，我們的研究表明：與HSA 相比，SSS能促進IVF／ISCI后植入前胚胎的發(fā)育，增加優(yōu)質(zhì)胚胎和可用胚胎的數(shù)量，提高所獲取的卵母細胞的利用率。冷凍胚胎的增多意味著患者若在本治療周期未獲得妊娠，可以使用自然周期或者人工周期準備內(nèi)膜，而后進行胚胎復蘇移植，大大節(jié)省治療的時間和患者的花費。

但我們的研究同樣也表明，在IVF-ET 中，SSS的加入并沒有提高胚胎的植入率，也未改善臨床妊娠結(jié)局，這可能與移植時都是盡量選用優(yōu)質(zhì)胚胎有關(guān)。在ICSI-ET 患者中，SSS組的植入率甚至要低于HSA 組，這可能是因為SSS組患者的年齡顯著地高于HSA 組。而后分年齡階段的統(tǒng)計分析顯示，在不同年齡組（＜35 組和≥35 歲組），SSS 和HSA 對臨床妊娠率和胚胎著床率的影響沒有統(tǒng)計學差異，進一步證實ICSI組臨床妊娠結(jié)局的主要是受患者年齡的影響。而造成年齡差異的根本原因可能是自2013年底，山東省通過了單獨二孩的計劃生育政策，這使得大量年齡偏大的育齡婦女求助于輔助生殖技術(shù)來實現(xiàn)自己的二胎夢，年齡的偏大造成了卵巢功能的低下，超排卵后獲得的卵母細胞數(shù)目也明顯減少，以至于在移植時可用胚胎的數(shù)目也明顯降低。

對SSS作用機理的研究顯示，培養(yǎng)液中SSS的加入可以提高囊胚的孵出率，降低活性氧自由基的水平，減少胚胎卵裂球的凋亡［14］，此外SSS對植入前胚胎發(fā)育的促進作用也可能與SSS 中氨基酸含量較高有關(guān)［15］。

總之，SSS能促進IVF／ICSI-ET 中植入前胚胎的發(fā)育，提高卵母細胞的利用率，可以作為優(yōu)化胚胎培養(yǎng)方案的蛋白添加物。

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