肝豆靈干預(yù)銅負(fù)荷大鼠腎損傷的代謝組學(xué)研究*

蔣懷周，王 鍵，許晶晶，董繼揚(yáng)

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥230031；2.廈門大學(xué)電子科學(xué)系，福建省等離子體與磁共振研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

Wilson ?。╓ilson disease，WD）是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由英國神經(jīng)病學(xué)家Samuel Alexander Kinnier 在1912 年首次描述而得名。該病患者由于ATP7B 基因缺陷，導(dǎo)致機(jī)體合成銅藍(lán)蛋白障礙、膽汁排銅減少，銅離子沉積于各組織器官[1]。若銅沉積于腎臟，可致腎小管損傷，重吸收功能發(fā)生障礙，引起相應(yīng)臨床表現(xiàn)。

中醫(yī)藥治療本病具有一定的優(yōu)勢(shì)，其中，肝豆靈片以肝豆湯為基本方優(yōu)化組合而成，是安徽省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，被應(yīng)用于臨床已有40 年歷史[2-3]，臨床實(shí)踐及科研實(shí)驗(yàn)證明本方對(duì)WD 具有一定的排銅和治療作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)以代謝組學(xué)方法對(duì)肝豆靈干預(yù)的銅負(fù)荷大鼠腎組織進(jìn)行研究，期望從小分子代謝角度，探討肝豆靈的腎臟排銅機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸銅（上海國藥集團(tuán)）；乙醚（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司）；TUNEL 試劑盒（美國Roche 公司）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，3 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（皖）2011-002，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

石蠟切片機(jī)（安徽合肥電子研究所）；病理圖像分析儀（武漢清平影像技術(shù)有限責(zé)任公司）；Beckman 離心機(jī)（美國Beckman 公司）；移液器（德國Eppendorf 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）；高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司）；布魯克600MHz 核磁共振譜儀（德國布魯克公司）。

1.4 動(dòng)物模型制備

造模過程中，正常組始終自由飲水?dāng)z食，模型組和肝豆靈組以銅負(fù)荷法[6]復(fù)制模型大鼠：連續(xù)12周喂飼含硫酸銅的飼料（1g/kg）和水（0.185%）。自第7 周開始，每日1 次，以肝豆靈灌胃肝豆靈組大鼠，藥物灌胃劑量為0.486g/kg；模型組和肝豆靈組以等容量生理鹽水灌胃。依據(jù)文獻(xiàn)[7]，若偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖中，3 組大鼠分別處于不同區(qū)域，且組內(nèi)較為聚集，說明3 組大鼠代謝有差異，造模成功。造模過程中，去除不明原因死亡大鼠，剩余大鼠為正常組8 只，模型組10 只，肝豆靈組17 只。

1.5 樣本采集

造模結(jié)束后，將大鼠乙醚吸入麻醉，取新鮮腎組織，一份以液氮速凍后，置于超低溫冰箱-80℃保存，以備NMR 檢測(cè)；另一份從每組隨機(jī)取6 個(gè)樣品，以10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，待測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

結(jié)合文獻(xiàn)[8]，參照Roche 公司TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作實(shí)驗(yàn)。正常腎小管上皮細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）核呈棕褐色者。每張片隨機(jī)取3 個(gè)腎小管視野，計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI），計(jì)算方法：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%. 以SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 腎組織提取

將所取腎組織加入由甲醇和蒸餾水配置的溶液里，低溫勻漿；加氯仿漩渦；加蒸餾水漩渦；低溫高速（4℃，10 000r/min）離心樣品；所得上清液移至離心管；真空干燥箱抽干甲醇；凍干機(jī)中將剩余液體凍干成粉末，保存于超低溫冰箱-80℃。

2.3 1H NMR 譜采集

常溫解凍粉末樣品，加入含TSP 的重水配置的磷酸鹽緩沖液震蕩；低溫離心（4℃，10 000r/min）10min，取上清液轉(zhuǎn)移至核磁管內(nèi)。以Bruker 600MHz譜儀核磁采樣，實(shí)驗(yàn)溫度296K。預(yù)飽和脈沖序列ZGPR（RD-90°-ACQ）采集1H NMR 譜，譜寬12kHz，弛豫延時(shí)2s，采樣點(diǎn)數(shù)32K，累加次數(shù)64 次。

2.4 1H NMR 譜圖處理

MestreNova 9.0 軟件打開fid 數(shù)據(jù)，傅里葉變換為NMR 譜。以TSP 譜峰為零點(diǎn)定標(biāo)NMR 譜，相位校正和基線校正NMR 譜，以自編軟件進(jìn)行譜峰對(duì)齊，截去殘余水信號(hào)和甲醇信號(hào)后，對(duì)剩余區(qū)域進(jìn)行分段積分。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行概率商歸一化（PQN）[9]，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 軟件（version 14.0，Umetrics，Sweden）進(jìn)行多變量分析。

3 結(jié)果

3.1 腎小管上皮細(xì)胞凋亡結(jié)果

腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示：正常組腎小管上皮細(xì)胞凋亡較少，呈散在分布；與正常組相比，模型組上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)增多（P＜0.01）；與模型組相比，肝豆靈組上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)減少（P＜0.01），見表1。

圖1 腎小管上皮細(xì)胞凋亡（TUNEL，×400）

表1 3 組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)

3.2 代謝輪廓分析

大鼠腎組織典型1H NMR 譜見圖2。參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-11] 和HMDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.hmdb.ca），將代謝物作出如下歸屬：

為了分別分析3 組代謝物之間的差異，我們對(duì)樣品預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA 分析。根據(jù)PLS-DA 得分圖里點(diǎn)的聚集情況可以判斷樣品類別差異，本實(shí)驗(yàn)3 組樣品分別在得分圖（圖3）中處于不同區(qū)域，說明樣品間存在代謝差異。R2X、R2Y 和Q2是所建立模型的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，交叉核實(shí)參數(shù)Q2是模型的累積預(yù)測(cè)程度，可反映預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，Q2>0.4 時(shí)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可通過[12]，而本實(shí)驗(yàn)正常組-模型組-肝豆靈組、正常組-模型組、模型組-肝豆靈組的Q2分別為0.939，0.977，0.942。對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品的PLS-DA 模型進(jìn)行200次的排列實(shí)驗(yàn)，如圖4 所示，正常組-模型組、模型組-肝豆靈組模型的解釋能力R2和預(yù)測(cè)能力Q2擬合線斜率大于0，提示它們?cè)赑LS-DA 模型得分圖的區(qū)分并非偶然，模型有效，驗(yàn)證通過，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡結(jié)果，說明造模成功[7]，藥物干預(yù)有效。

圖2 3 組大鼠腎組織的典型1H NMR 譜

圖3 腎組織樣品的PLS-DA 得分圖

圖4 腎組織樣品的PLS-DA 模型驗(yàn)證圖

根據(jù)代謝物譜峰在PLS-DA 模型的VIP 值、回歸系數(shù)值以及t 檢驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)3 組組間差異貢獻(xiàn)較大的代謝物，并將這些差異代謝物列入表2。

4 討論

腎臟是機(jī)體代謝最重要的器官之一，通過尿液的生成和排泄，它可以排出人體大部分的代謝最終產(chǎn)物，調(diào)節(jié)人體水、電解質(zhì)和酸堿平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。WD 患者腎組織銅含量約比正常人高10 倍左右，由于腎小管上皮細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)和功能，銅主要沉積在WD 患者腎臟近端小管、遠(yuǎn)端小管，腎小球囊亦有銅粒沉著。光鏡下可見患者近端腎小管上皮細(xì)胞扁平化、基底膜增厚、刷狀緣消失，部分遠(yuǎn)端小管上皮輕度脂肪變性，腎小球毛細(xì)血管管腔狹窄或者閉塞。隨著病情加重，患者可出現(xiàn)腎小管重吸收功能障礙，臨床表現(xiàn)為腎性糖尿、蛋白尿和氨基酸尿等，少數(shù)患者可發(fā)生腎小管性酸中毒、腎病綜合征等[13]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，肝豆靈組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，說明銅負(fù)荷造模對(duì)大鼠腎臟造成了一定的損傷，而肝豆靈可有效抑制銅負(fù)荷所導(dǎo)致的腎損傷。

表2 大鼠腎組織特征代謝物

肝豆靈主要由大黃、黃連、黃芩、半枝蓮、穿心蓮、萆薢、澤瀉、金錢草等組成。其中，大黃清熱通腑，蕩滌熱結(jié)，黃連、黃芩、半枝蓮、穿心蓮苦寒清熱，瀉火解毒，萆薢、澤瀉、金錢草瀉熱通淋、利濕祛濁。以上諸藥合用，可起到清熱解毒，通腑利尿的作用，不僅能夠促進(jìn)尿銅的排泄，還可以促進(jìn)銅從其正常渠道膽汁排出。以肝豆靈治療WD 腎損傷患者，發(fā)現(xiàn)本方可降低患者的尿微量蛋白含量，提示肝豆靈對(duì)WD 腎損傷具有一定的干預(yù)作用[14]。本方的君藥是大黃，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，以大黃水煎劑干預(yù)慢性腎功能衰竭大鼠，可降低模型大鼠血清肌酐和尿素氮水平，改善腎性貧血癥狀，糾正鈣、磷、鎂等電解質(zhì)代謝紊亂和酸中毒，改善蛋白質(zhì)代謝紊亂，對(duì)腎小管損傷有一定的保護(hù)作用[15]。在同樣是金屬中毒所致的腎損傷研究中發(fā)現(xiàn)，大黃的有效成分大黃酸可降低鎘中毒所引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕亞慢性鎘中毒小鼠的腎損傷[16]。本方其他成分如半枝蓮具有抗氧化活性，能夠減輕小鼠腎臟氧化應(yīng)激所致細(xì)胞凋亡[17]，黃連[18]、黃芩[19]、萆薢[20]、金錢草[21]、澤瀉[22]對(duì)多種腎臟損傷具有不同角度的干預(yù)作用。

本實(shí)驗(yàn)以肝豆靈干預(yù)銅負(fù)荷模型大鼠，結(jié)果顯示模型大鼠苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、肌苷、天冬氨酸含量降低，給予肝豆靈干預(yù)后，這些小分子含量有所恢復(fù)。

苯丙氨酸和酪氨酸屬于芳香族氨基酸，苯丙氨酸羥化酶可催化苯丙氨酸生成酪氨酸。腎臟與芳香族氨基酸的合成、分解和排泄密切相關(guān)，是體內(nèi)芳香族氨基酸代謝的主要器官之一[23]，也是苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸的一個(gè)重要場(chǎng)所[24]。文獻(xiàn)報(bào)道通過測(cè)芳香族氨基酸含量，可以幫助探知腎損傷情況[25-26]。在代謝組學(xué)研究中亦發(fā)現(xiàn)，腎損傷時(shí)芳香族氨基酸含量具有一定的改變[16，27]，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠腎組織苯丙氨酸和酪氨酸含量發(fā)生了變化，與以上研究結(jié)果相符。經(jīng)肝豆靈干預(yù)后，大鼠這兩種氨基酸含量有所恢復(fù)，說明肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷腎損傷的干預(yù)可能涉及芳香族氨基酸的代謝。

亮氨酸和纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸，它們作為氮的載體，在維持機(jī)體氮平衡和蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用。臨床上對(duì)于腎損傷的患者，可補(bǔ)充支鏈氨基酸，增加體內(nèi)蛋白合成，降低血尿素氮水平，有助于恢復(fù)病人的體能，是腎損傷病人重要的支持治療手段[28-29]。以基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究納米銅對(duì)腎臟的影響，發(fā)現(xiàn)銅染毒大鼠腎損傷涉及支鏈氨基酸的異常降解[30]。對(duì)模型小鼠狼瘡性腎炎研究發(fā)現(xiàn)，中成藥昆仙膠囊可升高模型小鼠異常降低的支鏈氨基酸水平，可能是該藥的治療作用途徑之一[31]。以上研究結(jié)果提示，腎損傷可能與支鏈氨基酸代謝具有一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M亮氨酸和纈氨酸含量降低，經(jīng)肝豆靈干預(yù)后其含量回升，提示肝豆靈可能通過調(diào)節(jié)支鏈氨基酸的代謝，幫助維持機(jī)體氮的平衡，干預(yù)銅過量對(duì)腎臟的損傷。

谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸是參與氨代謝的重要氨基酸，氨在腎臟的代謝主要由腎小管上皮細(xì)胞完成。肝豆靈干預(yù)后，大鼠腎組織谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量向正常范圍恢復(fù)，且腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組有所降低，可能提示肝豆靈對(duì)氨的代謝具有調(diào)節(jié)作用，或許與抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡具有一定聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)中，我們以核磁共振代謝組學(xué)方法分析肝豆靈干預(yù)銅負(fù)荷大鼠后，大鼠腎組織小分子代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠腎損傷具有一定的干預(yù)作用，其機(jī)制可能涉及對(duì)芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）、支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸）的調(diào)節(jié)；抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腎臟氨的代謝。本結(jié)果可為臨床對(duì)WD 患者的腎損傷治療提供一定的機(jī)制參考。

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