健脾方對(duì)皮膚屏障功能障礙模型小鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究*

孫曉菲，楊皓然，方 凱，解宇環(huán)

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500）

人體皮膚是直接與外界接觸的器官，為人體免疫系統(tǒng)的第一道屏障。皮膚屏障異常是導(dǎo)致皮膚疾病的重要因素，特應(yīng)性皮炎、銀屑病、接觸性皮炎等多種皮膚病的發(fā)生都與皮膚屏障功能的異常有關(guān)[1]。中醫(yī)藥治療上述疾病在緩解病情、防止復(fù)發(fā)、提高患者的生存質(zhì)量等方面具有一定優(yōu)勢(shì)。明申斗垣在《外科啟玄》中說(shuō)過(guò)：“言瘡雖生于肌膚之外，而其根本原集予臟腑之內(nèi)”[2]，現(xiàn)代醫(yī)家也多認(rèn)為皮膚疾病往往由內(nèi)外因合而發(fā)病，因而辨治也應(yīng)將局部皮膚辨證與整體臟腑辨證有機(jī)地結(jié)合起來(lái)內(nèi)外兼治，才能真正獲得滿意療效[3-5]。健脾法是中醫(yī)治療皮膚屏障障礙性疾病的重要治法，但對(duì)于該治法的研究，現(xiàn)多局限于方藥對(duì)患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的影響而較少關(guān)注對(duì)皮膚機(jī)械屏障的作用。因而本文選用健脾方中的代表方參苓白術(shù)散和六君子湯為研究對(duì)象，觀察兩方對(duì)小鼠皮膚屏障障礙模型的影響，揭示健脾法治療上述皮膚屏障功能障礙疾病的機(jī)制，并通過(guò)比較兩方對(duì)皮膚屏障的作用的差異，初步探討健脾滲濕法和益氣健脾法對(duì)皮膚屏障功能影響的異同。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥品與試劑

參苓白術(shù)散：人參60g，茯苓60g，炒白術(shù)60g，山藥60g，炒白扁豆45g，蓮子肉30g，炒薏苡仁30g，砂仁30g，炒桔梗30g，炙甘草60g；六君子湯：人參36g，茯苓36g，炒白術(shù)36g，炙甘草24g，陳皮12g，半夏18g，所有藥材均購(gòu)自昆明市“一心堂”連鎖藥店，經(jīng)中藥鑒定教研室張潔老師鑒定為正品。按方中比例水煎、過(guò)濾、濃縮制成浸膏，4℃保存。神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)sigma aldrich 公司），胰酶（Lot no：MR28175，法國(guó)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

YLS-Q4 耳腫打耳器，購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；HX086146 薄層色譜硅膠板，購(gòu)自德國(guó)Merck 公司；Vapo Meter 測(cè)量?jī)x，購(gòu)自芬蘭Delfin Technologies 公司，ECLIPSE 50i 生物顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon 公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

將健康ICR 小鼠，根據(jù)體質(zhì)量分層隨機(jī)分為8組。即正常對(duì)照組、模型組、參苓白術(shù)散和六君子湯組。除參苓白術(shù)散和六君子湯各組分別灌胃給予不同濃度的水煎液外，其余各組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1 次，連續(xù)13d。除正常對(duì)照組外，其余各組從給藥第9 天起，以膠帶法復(fù)制皮膚機(jī)械屏障障礙模型，剃去小鼠頸背部被毛后，用強(qiáng)力膠帶粘貼該處皮膚4～5 次，每日2 次，中間間隔8h，連續(xù)5d。造模第5 天，檢測(cè)完TEWL 值后將小鼠處死，取下造模處皮膚，用打耳器將取下的皮膚打成圓片供表皮厚度測(cè)量和神經(jīng)酰胺檢測(cè)。

2.2 表皮經(jīng)皮水分丟失量（TEWL）測(cè)定

用Vapo Meter 測(cè)量?jī)x測(cè)定小鼠頸背部皮膚TEWL，室溫20～25℃，空氣相對(duì)濕度50%～60%. 測(cè)量?jī)x器與測(cè)量部位皮膚表面垂直接觸，每一測(cè)試部位測(cè)量3 次，讀出數(shù)值并記錄，取其平均值。

2.3 表皮厚度測(cè)量

10%中性甲醛中固定小鼠表皮48h 后，脫水、包埋、HE 染色。于40 倍鏡下從視野觀察到的皮膚最上端開始拍第一張圖片，之后顯微鏡標(biāo)尺每移動(dòng)2mm 拍一張圖片，每張圖片取5 圖，圖片拍完后用Image-Pro plus 6.0 形態(tài)學(xué)分析軟件在每張圖片上任選5 個(gè)點(diǎn)，一張皮膚共選25 個(gè)點(diǎn)測(cè)量小鼠的表皮厚度，再將25 點(diǎn)的厚度值取平均值即為每只小鼠表皮厚度值。

2.4 表皮神經(jīng)酰胺含量的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道方法。

2.4.1 表皮脂質(zhì)的提取

用打耳器打成面積約為50mm2大小的皮膚圓片共6 片。將所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴1h，4℃冰箱放置過(guò)夜后取出，分離表皮，以Bligh＆Dyer法[7]抽提表皮脂質(zhì)，氮?dú)獯蹈桑?80℃冰箱保存。

2.4.2 對(duì)照品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取神經(jīng)酰胺對(duì)照品5.0mg，加氯仿定容，得0.2mg·mL-1對(duì)照品溶液。精密吸取2，4，6，8，10，12，14μL 神經(jīng)酰胺對(duì)照品溶液點(diǎn)于薄層板上展開，晾干后再于氯仿∶甲醇∶氨水=90∶10∶0.5 中展開；噴灑顯色劑于140℃下烘干顯色。顯色后采集圖片并用Image J 軟件分析，測(cè)定灰度值。經(jīng)計(jì)算得到回歸方程：y=5346.3x+4222.2，R2=0.9973，線性關(guān)系良好，線性范圍為0.4～2.8μg。

2.4.3 小鼠皮膚神經(jīng)酰胺含量測(cè)定

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述條件測(cè)定灰度值，最終換算出神經(jīng)酰胺含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊，組間兩兩比較采用LSD 法；方差不齊的采用秩和檢驗(yàn)。取P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠皮膚TEWL 的影響

與正常對(duì)照組比較，皮膚屏障障礙模型小鼠TEWL 增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，參苓白術(shù)散和六君子湯組均能能減少TEWL（P＜0.01），其中參苓白術(shù)散組較六君子湯組TEWL 明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠皮膚TEWL值的影響

3.2 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度的影響

與正常對(duì)照組比較，皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，參苓白術(shù)散組和六君子湯組能降低小鼠表皮厚度（P＜0.05），而兩給藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度的影響

3.3 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠皮膚神經(jīng)酰胺含量的影響

與正常對(duì)照組比較，皮膚屏障障礙小鼠神經(jīng)酰胺含量降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，參苓白術(shù)散組和六君子湯組能升高小鼠皮膚中神經(jīng)酰胺含量（P＜0.01，P＜0.05），而兩給藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 健脾方對(duì)皮膚屏障障礙小鼠皮膚神經(jīng)含量的影響

4 討論

皮膚屏障有廣義和狹義之分，廣義的皮膚屏障主要涉及與皮膚各層結(jié)構(gòu)相關(guān)的屏障；狹義的皮膚屏障主要包括皮膚角質(zhì)層（SC）結(jié)構(gòu)相關(guān)的屏障[8]。皮膚屏障功能通常指表皮尤其是角質(zhì)層的物理性或機(jī)械性屏障結(jié)構(gòu)，主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是表面角質(zhì)形成細(xì)胞形成的角質(zhì)層、角質(zhì)細(xì)胞間的脂類、天然保護(hù)因子（Natural moisturizing factor，NMF）等[9]。角質(zhì)形成細(xì)胞間隔地“堆砌”于連續(xù)的富含特定脂類的細(xì)胞間基質(zhì)中而形成了經(jīng)典的“磚-墻”結(jié)構(gòu)體系[10]。角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)由大約50%神經(jīng)酰胺、25%膽固醇、15%游離脂肪酸和一些次要的脂質(zhì)組成[11]。神經(jīng)酰胺在調(diào)節(jié)皮膚的生物活性及表皮的生理功能中起重要作用，其減少可引起皮膚屏障功能異常和修復(fù)的延遲[12-13]。阻止水分經(jīng)皮擴(kuò)散和電解質(zhì)流失，這是皮膚角質(zhì)層最重要的屏障功能之一[14]。TEWL 并不直接表示角質(zhì)層的水分含量，而是表明水分經(jīng)角質(zhì)層散失的情況，TEWL 值越高，表明經(jīng)皮膚散失的水分越多，角質(zhì)層的屏障功能越差[15]。實(shí)驗(yàn)表明，小鼠表皮經(jīng)過(guò)膠帶反復(fù)粘貼后，TEWL 值升高，小鼠皮膚屏障功能下降。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)皮膚角質(zhì)層剝脫或過(guò)度增生、細(xì)胞層次增多，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)表皮中神經(jīng)酰胺含量降低，說(shuō)明該模型是通過(guò)破壞皮膚角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)、減少脂質(zhì)含量而造成皮膚屏障的功能障礙。

中醫(yī)理論認(rèn)為，脾主濕而惡濕，凡稟賦素弱、勞倦過(guò)度、飲食失宜，均能使脾失健運(yùn)、水濕內(nèi)停、釀成內(nèi)濕、浸淫肌膚、走竄四肢而外發(fā)皮膚病。治以健脾助運(yùn)、兼理濕邪。健運(yùn)中土，則脾氣轉(zhuǎn)強(qiáng)，水谷得化；內(nèi)濕消除，則輸津于膚，外燥自解[16]。給予健脾方參苓白術(shù)散和六君子湯后，二者均能降低模型小鼠的TEWL 值，減少表皮厚度，提高表皮神經(jīng)酰胺的含量，說(shuō)明即便沒(méi)有脾虛見證，健脾方藥對(duì)皮膚屏障功能障礙也有修復(fù)作用。參苓白術(shù)散是臨床上常用的健脾滲濕代表方藥，具有益氣健脾，滲濕止瀉之功效。本研究發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散對(duì)皮膚功能障礙的改善作用優(yōu)于六君子湯，尤以降低TEWL 值為明顯，而對(duì)神經(jīng)酰胺含量的影響二者差異也表現(xiàn)出一定趨勢(shì)。這也初步證實(shí)了中醫(yī)臨床常以健脾與利濕治法相結(jié)合治療皮膚疾病的科學(xué)合理性。

[1] 胡珍，于春水. 皮膚屏障功能的研究進(jìn)展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（7）：3101-3103.

[2] 何丹，林青，王妍. 特應(yīng)性皮炎的中醫(yī)辨證及用藥規(guī)律[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（4）：67-70.

[3] 劉朝霞，韓曉冰，張成會(huì)，等. 運(yùn)用健脾祛濕法治療銀屑病思路[J]. 中醫(yī)雜志，2012，53（23）：2005-2006.

[4] 李芳梅. 中醫(yī)藥在某些皮膚病皮膚屏障功能修復(fù)中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2014，23（8）：684-686.

[5] 楊雪松，葉建州，李欽. 健脾養(yǎng)血祛風(fēng)法治療特應(yīng)性皮炎臨床療效及對(duì)皮膚屏障功能的影響[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（3）：5-7.

[6] 王妍，林青，謝金梅，等. 薄層色譜結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定小鼠表皮神經(jīng)酰胺含量 [J]. 中藥新藥與臨床藥理，2008，19（4）：281-282.

[7] Bligh EG，Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification [J]. Can J Biochem Physiol，1959，37（8）：911-917.

[8] 楊揚(yáng)，馬慧軍，胡蓉. 皮膚角質(zhì)層的相關(guān)屏障結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2012，21（1）：158-161.

[9] 田燕，劉瑋. 皮膚屏障[J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2013，6（6）：346-348.

[10] Harding CR.The stratum corneum：structure and function in health and disease[J].Dermatol Ther，2004，17（S1）：6-15.

[11] Jungersted JM，Hellgren LI，Jemec GB，et al. Lipids and skin barrier function - a clinical perspective [J]. Contact Dermatitis，2008，58（5）：255-262.

[12] Meckfessel MH，Brandt S. The structure，function，and importance of ceramides in skin and their use as therapeutic agents in skin-care products [J]. J Am Acad Dermatol，2014，71（1）：177-184.

[13] 吳金燕，蔣獻(xiàn). 神經(jīng)酰胺與皮膚屏障[J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（1）：64-65.

[14] Darlenski R，Sassning S，Tsankov N，et al. Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties[J].Eur J Pharm Biopharm，2009，72（2）：295-303.

[15] 趙鑫. TEWL 在評(píng)價(jià)皮膚屏障功能研究中的應(yīng)用[J]. 廣東化工，2014，41（14）：133-134.

[16] 李博鑑. 皮科證治概要[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：626.