蒙脫石對胰島素的吸附及其緩釋性能研究

彭 琪，朱維鈞，楊春柳，于永生，朱建君，楊性坤

(1.信陽師范學院 化學化工學院，河南 信陽 464000；2. 平頂山學院 數(shù)學與信息科學學院，河南 平頂山 467000)

0 引言

蒙脫石(montmorillonite, MMT)是一種生物惰性黏土類礦物質(zhì)，分子式為(Al,Mg)[Si4O10](OH)2·nH2O，是由硅氧四面體和鋁氧八面體所組成的2∶1型層狀硅酸鹽礦物，是膨潤土的主要礦物成分.[1]它的化學成分相當穩(wěn)定，具有無毒、耐化學溶劑、粒徑小、晶層可被嵌入、比表面積大、易于吸附分子及較強的離子交換能力等特點[2]，它能將陽離子藥物插入MMT片層間的空隙內(nèi)，使藥物能夠緩慢地釋放出來.[3]根據(jù)含有的可交換陽離子的種類，MMT可被分為鈣基蒙脫石和鈉基蒙脫石.[4]我國出產(chǎn)的天然黏土約90%屬于鈣基蒙脫石，然而鈉基蒙脫石具有更好的吸附性及離子交換性.因此，在實驗中開發(fā)利用MMT作為藥物釋放載體通常先將鈣基蒙脫石提純轉(zhuǎn)化為鈉基蒙脫石.[5]胰島素(Insulin, INS)是一種在人和動物機體內(nèi)的能夠降低血糖的激素，在醫(yī)學上主要被用于糖尿病的治療.然而，由于胃酸的破壞、消化酶的降解及難以跨越生物膜的機械屏障作用等因素，目前，胰島素只能以注射的形式給藥，而且通常需要長期反復地頻繁給藥，這給患者帶來了極大的痛苦.[6]為了解決以上問題，國內(nèi)外的學者進行了大量有關口服胰島素制劑的研究，包括選擇可生物降解高分子材料、藥物結(jié)合鏈斷裂等手段，從而有望實現(xiàn)胰島素的口服給藥.[7-11]

本實驗以河南信陽的鈣基蒙脫石為原料，先將其轉(zhuǎn)化為鈉基蒙脫石，再以胰島素為模型藥物，在一定條件下制備出INS/MMT復合物，考察鈉基蒙脫石對胰島素的吸附能力，研究pH值和釋放時間等因素對復合物體外釋放胰島素的影響規(guī)律，采用一級動力學模型、Higuchi模型和Korsmeyer- Peppas模型分析INS在不同pH值下的釋放機理，探討蒙脫石作為胰島素的藥物緩釋載體的可行性，為進一步開發(fā)口服胰島素制劑提供理論參考.

1 實驗部分

1.1 樣品制備

膨潤土樣品采自河南信陽.先采用濕法對膨潤土原礦進行提純，再用1 mol/L NaCl溶液對鈣基膨潤土進行鈉化改性.提純改性后，鈉基蒙脫石中雜質(zhì)的含量大大降低，測定其陽離子交換容量為72.3 mmol/100 g，吸藍量為40.05 mL，計算后得知，提純后鈉基蒙脫石的含量約為91%，該純度可以滿足后續(xù)實驗的相關要求.[12]

其他主要原料：胰島素精粉(提取于豬胰腺，徐州萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，27.5 IU/mg)，濃鹽酸，甘氨酸，考馬斯亮藍G-250，95%乙醇，85%磷酸，牛血清白蛋白，氨水，氯化銨.實驗中所用化學試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水.

準確稱取600 mg胰島素粉末，加入到300 mL pH 3.5的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液中，充分溶解后加入150 mg鈉基蒙脫石，攪拌9 h后離心，從中取適量濾液，稀釋后在595 nm處測定吸光度.將沉淀用蒸餾水洗滌2～3次，干燥研磨后得到INS/MMT復合物，儲存于干燥器中備用.[13]

1.2 性能測試

使用日本HITACHI-U3900H型UV-Vis分光光度計測定分析溶液中INS的濃度.

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制[14-15]

準確稱取10 mg牛血清白蛋白，將其溶于10 mL蒸餾水，即得1 g/L的標準蛋白溶液.另準確稱取10 mg考馬斯亮藍G-250，溶于5 mL95%乙醇中，加入10 mL85%(W/V)磷酸，用蒸餾水定容至100 mL，即得0.1 g/L的考馬斯亮藍溶液.精確吸取標準蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，分別用蒸餾水稀釋至1 mL，再依次加入5 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻.以不含牛血清白蛋白的試樣為空白對照，在595 nm處于5 min內(nèi)完成吸光度測定，并繪出標準曲線.結(jié)果表明，在0～100 mg/L范圍內(nèi)，吸光度與濃度之間具有良好的線性關系，其相關系數(shù)R為0.999 5.

1.3.2 MMT對INS的包封率和載藥量[16]

采用下面式子計算MMT對INS的包封率和載藥量.

包封率EN=m1/m2×100%,

(1)

其中：EN為蒙脫石的包封率，%；m1為復合物中包載的INS的質(zhì)量，mg；m2為復合物形成后上層清液中INS的總質(zhì)量，mg.

載藥量DL=m1/m3×100%,

(2)

其中：DL為蒙脫石的載藥量，%；m1為復合物中包載的INS的質(zhì)量，mg；m3為復合物形成后上層清液中蒙脫石的質(zhì)量，g.

1.3.3 INS/MMT 復合物的體外釋放

準確稱取3份30 mg INS /MMT復合物，分別置于pH為7.4、5.0和1.2的釋放介質(zhì)中，密封后置于錐形瓶中，在37 ℃下于恒溫振蕩器中對復合物進行體外釋放試驗.在適當?shù)臅r間取樣，同時向體系中補充等量的新鮮釋放介質(zhì).用紫外可見分光光度計測定樣品在595 nm處的吸光度，通過計算得出釋放介質(zhì)中INS的濃度和累積釋放量.

2 結(jié)果與討論

2.1 MMT對INS的包封率和載藥量

由實驗數(shù)據(jù)計算蒙脫石對INS的包封率和載藥量，得到如下實驗結(jié)果：鈉基蒙脫石對INS的包封率為22.76%，載藥量為910.34 mg/g.這說明蒙脫石對INS具有較強的吸附能力.[12]

2.2 INS/MMT復合物的體外釋放

將復合物在3種不同pH下進行釋放實驗，測定了在不同取樣時間下從INS/MMT 復合物中釋放出的INS濃度，結(jié)果見圖1.

圖1 INS/MMT 復合物在不同 pH 下的釋放曲線Fig. 1 The release curve of INS from the INS/MMT complexes in various pH aqueous solutions

對于在3種pH值下的緩釋實驗，我們采用3個理論模型：一級動力學模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型來研究INS從復合物中釋放的機理.[17-20]擬合結(jié)果見圖2、圖3、圖4和表1.其中，一級動力學模型常用于多孔骨架系統(tǒng)中水溶性藥物的釋放動力學研究，可用公式(3)表示：[17]

Qt=Q∞(1-Me-kt/Q∞).

(3)

基于菲克定律，Higuchi模型把藥物的釋放描述成擴散過程，是擴散型藥物釋放系統(tǒng)的典型模型，可用公式(4)表示：[20]

Qt=kHt1/2.

(4)

Korsmeyer-Peppas模型考慮到藥物分子的釋放機理通常并不完全符合菲克定律，而會表現(xiàn)出一定的無規(guī)則性，則可用公式(5)表示：[21]

Qt=kHtn,

(5)

其中：Qt是在t時刻藥物累積釋放的百分含量；Q∞是在平衡狀態(tài)下藥物釋放的百分含量；M是藥物的釋放量；t是釋放時間；k是一級釋放動力學常數(shù)；kH是Higuchi擴散常數(shù)，k1是Korsmeyer-Peppas模型的動力學常數(shù)；n是釋放指數(shù).其中，當0.45

圖2 一級動力學模型擬合INS在不同 pH 下的釋放Fig. 2 Curve fitting of INS release rate with first order kinetics model in various pH aqueous solutions

圖3 Higuchi模型擬合INS在不同pH下的釋放Fig. 3 Curve fitting of INS release rate with Higuchi model in various pH aqueous solutions

由圖1、圖2、圖3和圖4可知：INS/MMT復合物中INS的釋放行為受溶液pH值影響較大，當pH為7.4和1.2時，INS的釋放濃度和累積釋放量的最大值分別為181.71 mg/L、14.54%和177.85 mg/L、14.23%，均遠大于pH 5.0時的釋放情況.雖然當pH 1.2時，復合物中INS的釋放累積量在12 h內(nèi)明顯高于pH 7.4時的結(jié)果，但由于INS在強酸性介質(zhì)中存在12 h后會發(fā)生部分降解，因此測得的釋放濃度在釋放24 h時反而有所下降(使用紫外可見分光光度計在不同時間點對INS在3種pH下進行峰形掃描，數(shù)據(jù)未給出).由此可見，中性和強酸性條件會更有利于INS從復合物中釋放出來.

圖4 Korsmeyer-Peppas模型擬合INS在不同 pH 下的釋放Fig. 4 Curve fitting of INS release rate with Korsmeyer-Peppas model in various pH aqueous solutions

由于胰島素的等電點約為5.1，在pH 5.0時稍帶正電荷，在pH 1.2時帶正電荷，在pH 7.4時帶負電荷，所帶的電荷越多，蒙脫石片層間胰島素分子間的靜電排斥作用越強，從而使得INS更容易釋放出來.這使胰島素在pH 1.2時比在pH 7.4時更容易釋放出來.另外，在pH 7.4時，插入到蒙脫石層間的INS與溶液中的磷酸根等陰離子間進行的離子交換作用對藥物釋放也有一定的貢獻.[14]當pH 值在胰島素等電點附近時，INS所帶的電荷最少，復合物中INS的釋放濃度和累積釋放量最低.

當pH 7.4時，在釋放的前12 h，復合物中INS的釋放濃度和累積釋放量均隨時間的延長而增大.在12 h后，其釋放速率逐漸變緩，釋放濃度和累積釋放量趨于穩(wěn)定.當pH 1.2時，在7 h后，INS的釋放速率就逐漸穩(wěn)定下來.但是當pH 5.0時，在整個釋放周期內(nèi)，INS的釋放曲線都很平緩，釋放濃度和累積釋放量均很小.由此，我們可以認為：INS/MMT復合物中INS的釋放過程可分為2個階段：第一階段為初期，INS的釋放速率相對較快，釋放的可能是吸附在鈉基蒙脫石表面的INS，此外由于存在復合物和釋放介質(zhì)間的濃度梯度，蒙脫石表面的INS會不斷從復合物中擴散到溶液中.第二階段是較緩慢的持續(xù)釋放過程，此時釋放的可能是插入到蒙脫石層間的INS.

將INS/MMT復合物在3種pH下的釋放數(shù)據(jù)按照一級動力學方程、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型進行擬合，由擬合優(yōu)度(R2)來判斷曲線擬合情況，擬合結(jié)果見表1.由擬合結(jié)果可見，在3種不同pH下，一級動力學方程擬合的結(jié)果最好，為藥物釋放的最佳模型.由此可推測，當INS從復合物中釋放出來時，在濃度差的作用下，蒙脫石表面吸附的INS分子迅速擴散，蒙脫石層間的INS也將通過擴散作用進入溶液.此外，在3種pH下，采用Korsmeyer-Peppas模型擬合的釋放指數(shù)都小于0.45，這說明INS從復合物中的釋放是基于Fickian擴散機理.

綜上所述，INS/MMT復合物在中性和強酸性條件下可有效釋放出INS，并使藥物濃度保持恒定，因此，蒙脫石是一種性能優(yōu)良的胰島素緩釋載體.這為在將來的研究中尋求一種吸附能力強、穩(wěn)定性好且價格低廉的口服胰島素制劑提供了理論依據(jù)，同時也為河南省信陽地區(qū)礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用提供了參考依據(jù).

表1胰島素在3種pH值釋放介質(zhì)中釋放的不同動力學模型擬合結(jié)果
Tab. 1FittingresultsofinsulinreleaseratewiththreedifferentkineticmodelsinthreepHaqueoussolutions

3 結(jié)論

本研究表明：鈉基蒙脫石對胰島素具有較高的吸附能力和緩釋作用；復合物中胰島素的釋放行為受釋放介質(zhì)pH值的影響較顯著；采用不同模型對釋藥過程進行擬合，結(jié)果表明一級動力學模型的擬合效果最好，這說明胰島素從復合物中釋放的行為主要由擴散作用決定.接下來，本研究將著重對如何提高藥物的載藥量和包封率進行深入研究.