流動注射化學(xué)發(fā)光檢測藥物制劑中異丙腎上腺素及機(jī)理研究

王 輝，曹俊濤，李 森，劉彥明

(信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

異丙腎上腺素(IP)是一種擬交感β腎上腺素受體激動劑藥物，常應(yīng)用于治療支氣管炎、心肌梗死和心臟病[1].然而IP的過度使用，可能會引起心力衰竭和心律失常[2].因此，IP的檢測在臨床試驗和藥物制劑生產(chǎn)中都很重要.目前，用于檢測IP的分析方法主要包括分光光度法(如紫外可見分析方法)[3]、熒光法[4]、電化學(xué)分析法[5]和化學(xué)發(fā)光法[6].近年來，化學(xué)發(fā)光法(CL)因其靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡單等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注.目前，該技術(shù)已被用于毛細(xì)管電泳[7]、免疫測定[8]和流動注射(FI)[9]分析中.CL檢測與FI技術(shù)相結(jié)合具有靈敏度高、通量高、重現(xiàn)性好、速度快等優(yōu)點(diǎn).FI-CL方法已被用于多種化合物的分析，包括氨基酸[10]、蛋白質(zhì)[11]、核酸[12]和藥物制劑[13]等.Sun等人[14]基于IP對luminol-KClO3化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用，提出了一種檢測IP的FI-CL方法.

基于IP對luminol-KIO4化學(xué)發(fā)光體系的顯著增強(qiáng)作用，本文提出了一種靈敏檢測IP的FI-CL方法，對影響CL和重現(xiàn)性的條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化.將該方法應(yīng)用于藥物制劑鹽酸異丙腎上腺素注射液中異丙腎上腺素含量的檢測，對IP-luminol-KIO4化學(xué)發(fā)光體系信號增強(qiáng)的機(jī)理也進(jìn)行了討論.

1 實驗部分

1.1 試劑與溶液

異丙腎上腺素,Sigma公司(美國)；luminol,蘇州亞科化學(xué)試劑有限公司;KIO4,北京西輝化工廠;鹽酸異丙腎上腺素注射液(H31021344),上海醫(yī)藥有限公司;所有氨基酸均購自中國藥品生物制品鑒定所，其他化學(xué)試劑均為分析純；所用溶液均用超純水配制，18.2 MΩ·cm，臺灣艾柯-成都康寧實驗專用純水設(shè)備廠.

1.2 儀器裝置

FI-CL分析采用IFFM-E型FI-CL分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司，中國)，示意圖見文獻(xiàn)[9].系統(tǒng)包括兩個蠕動泵(P1, P2)、一個換向閥(S)、兩個Y型混合閥(Y1, Y2)、流通池(F)和CL檢測器(光電倍增管).蠕動泵用于所有溶液的傳輸.聚四氟乙烯管(直徑0.8 mm)用于連接流通體系中各部分組件.螺旋形無色硅膠管作為流通池置于光電倍增管上方.CL信號由FI-CL系統(tǒng)軟件記錄.UVmini-1240型紫外可見分光光度計(島津Shimadzu，京都，日本)用于測定紫外吸收光譜圖.CL光譜圖通過Cary Eclipse型熒光分光光度計(Varian，沃爾納特克里克，美國)測定，測定時關(guān)閉激發(fā)光源.

1.3 實驗方法

在該FI-CL分析體系中，一個分析過程包括兩個步驟.在第一步的前2 s，當(dāng)換向閥的方向位于負(fù)載位置時，水和空白溶液(或樣品溶液)通過泵P1以恒速0.68 mL/min被引入流動體系.同時，luminol和KIO4溶液通過泵P2以1.4 mL/min引入體系.在第二步的前25 s，換向閥、泵P1和泵P2同時運(yùn)行，換向閥的方向改為檢測位置.水和空白溶液(或樣品)通過泵P1以1.14 mL/min的速度被泵入.Luminol和KIO4通過泵P2以0.23 mL/min速度被泵入.在第二步的最后幾秒鐘，換向閥由檢測位轉(zhuǎn)向負(fù)載位，樣品與luminol和KIO4的混合溶液在流通池中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生CL信號.實驗發(fā)現(xiàn)，IP對luminol-KIO4系統(tǒng)具有顯著增強(qiáng)作用.因此，IP的濃度可以通過CL信號強(qiáng)度的變化(△ICL)進(jìn)行定量，△ICL=IS-I0，其中IS和I0分別為IP和空白溶液的CL強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

為實現(xiàn)靈敏檢測，對NaOH、luminol和KIO4的濃度進(jìn)行了優(yōu)化.在0～0.24 mol/L范圍內(nèi)對NaOH濃度進(jìn)行優(yōu)化，如圖1a所示，CL隨NaOH濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)濃度增至0.12 mol/L時達(dá)最大值，進(jìn)一步增加NaOH濃度，CL強(qiáng)度下降.因此，選擇NaOH濃度為0.12 mol/L.Luminol作為該體系中的化學(xué)發(fā)光試劑，其濃度也有重要影響.由圖1b可知，CL強(qiáng)度隨著luminol濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.5×10-4mol/L時，CL強(qiáng)度最大，之后CL強(qiáng)度變化不明顯，故選用的luminol濃度為1.5×10-4mol/L.考察了氧化劑KIO4在4.0×10-5～6.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)對CL強(qiáng)度的影響(如圖1c所示)，可見，當(dāng)KIO4濃度為2.5×10-4mol/L時CL強(qiáng)度最大，進(jìn)一步增加濃度信號下降.所以，選取KIO4的濃度為2.5×10-4mol/L.

圖1 NaOH(a)，luminol(b)和KIO4(c)濃度對CL強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effects of the concentrations of NaOH (a), luminol (b) and KIO4 (c) on CL intensity

2.2 FI-CL體系運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化

為實現(xiàn)高的靈敏度和好的重現(xiàn)性，對FI-CL系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果見表1.

表1 系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化及結(jié)果Tab.1 Effects of running parameters of FI-CL system and the optimum values

2.3 線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性

在優(yōu)化實驗條件下，體系的CL強(qiáng)度與IP濃度有關(guān).CL信號強(qiáng)度隨IP濃度的增加而增強(qiáng)(圖2)，其中IP濃度在5.0×10-9～1.5×10-6mol/L內(nèi)與△ICL呈線性關(guān)系，線性方程為△ICL= 2.4×1010C-836.2(C是IP的濃度)，相關(guān)系數(shù)為0.998 8(見圖2中插圖).檢出限為5.8×10-10mol/L.對5.0×10-7mol/L IP進(jìn)行12次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%.

圖2 IP對luminol-KIO4化學(xué)發(fā)光體系的增強(qiáng)作用 插圖：IP的標(biāo)準(zhǔn)曲線 a.無IP; b.1.0×10-7mol/L IP; c.5.0×10-7mol/L IP; d.9.0×10-7 mol/L IP.Fig. 2 The enhancement of IP on luminol-KIO4 CL reaction

2.4 干擾試驗

考察了一些常見的干擾物對IP測定的影響.選取IP的濃度為5.0×10-7mol/L，CL變化在±5%之內(nèi)視為基本不干擾，結(jié)果見表2.由表2可知，所列的物質(zhì)對IP的測定基本不干擾，表明該方法對IP的測定具有較好的選擇性.

2.5 實際樣品分析

將提出的FI-CL方法應(yīng)用于藥物制劑鹽酸異丙腎上腺素注射劑中IP的檢測，結(jié)果見表3.由表3可以看出，IP測定值與標(biāo)定值相近.加標(biāo)回收率為99.2%～103.2%.連續(xù)11次平行測定樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于1.2%.結(jié)果表明，該方法對藥物制劑IP的檢測具有高的靈敏度和好的精確度.

表2 不同干擾物對IP測定的影響Tab.2 Tolerable concentration ratios for interfering species in the analysis of 5.0×10-7 mol/L IP

注：a.CL峰高的變化(%):(I干擾物+IP-IIP)/IIP.

表3 鹽酸異丙腎上腺素注射液中IP測定結(jié)果Tab. 3 Analytical results of IP in isoprenaline hydrochloride injection

2.6 機(jī)理研究

對luminol-KIO4化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的研究已有報道[15].研究表明，該化學(xué)發(fā)光體系的最大發(fā)光波長為425 nm，與3-aminophthalate(luminol的氧化產(chǎn)物)的發(fā)光光譜一致.為探索luminol-KIO4-IP體系的發(fā)光機(jī)理，分別測定了luminol-KIO4和luminol-KIO4-IP體系的化學(xué)發(fā)光光譜，如圖3所示.由圖3可知，luminol-KIO4和luminol-KIO4-IP體系的最大發(fā)光波長均為425 nm，表明兩體系的發(fā)光物質(zhì)相同，仍為3-aminophthalate.IP、KIO4、luminol、luminol-KIO4、luminol-KIO4-IP溶液的紫外可見光譜圖見圖4.由圖4可見，IP與KIO4混合后出現(xiàn)兩個新的吸收峰(315, 500 nm)，表明IP和KIO4之間發(fā)生了反應(yīng).據(jù)報道，多酚可以被氧化為苯氧自由基，所產(chǎn)生的能量使苯氧自由基由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)[16].IP是一種兒茶酚胺化合物，有一個含有兩個羥基的苯環(huán)和連接在苯環(huán)上的胺構(gòu)成，在強(qiáng)氧化劑存在下極易被氧化為激發(fā)態(tài).基于以上分析，IP對luminol-KIO4體系的CL增強(qiáng)機(jī)理如下：

圖3 CL光譜: a. luminol-KIO4; b. a + IP 實驗條件: luminol,1.5×10-4 mol/L;NaOH,0.12 mol/L;KIO4, 2.5×10-4 mol/L;IP,1.0×10-7 mol/L.Fig. 3 CL emission spectra of luminol-KIO4 (a) and luminol-KIO4-IP(b)

圖4 紫外可見吸收光譜：a,IP;b,luminol;c,KIO4; d,luminol-KIO4;e,luminol-KIO4-IP.實驗條件如圖3.Fig. 4 UV-visible spectra. a. IP; b. luminol;c.KIO4; d.luminol-KIO4;e.luminol-KIO4-IP

3 結(jié)論

基于IP對luminol-KIO4CL體系的顯著增強(qiáng)作用，提出了一種簡單、靈敏檢測IP的FI-CL新方法.該方法具有靈敏度高、精密度好和線性范圍等優(yōu)點(diǎn).將該方法應(yīng)用于藥物制劑中IP的檢測，為藥物等生物樣品中IP的分析提供了一種新技術(shù).