基于酪氨酸酶/離子液體-石墨烯納米復(fù)合界面的雙酚A電化學(xué)傳感器

馬 勇, 李 瑞, 劉貴深, 侯曉東, 黃奕娜, 李春涯*

(1. 中國石油大學(xué)勝利學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院, 山東 東營 257097； 2. 中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430074； 3. 廣東省潮州市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 潮州 521011 )

0 引言

雙酚A (Bisphenol A), 2，2-二(4-羥基苯基)丙烷(其分子結(jié)構(gòu)如圖1)，是重要的有機化工原料，具有類雌激素性能，攝入動物體內(nèi)后，能使人類或動物體內(nèi)的荷爾蒙功能和生理系統(tǒng)發(fā)生紊亂[1]，即使在濃度很低的情況下，仍會對生物體內(nèi)激素的合成、釋放和生理作用等產(chǎn)生影響，進(jìn)而造成機體的生殖、發(fā)育及行為異常，嚴(yán)重時會致癌、致畸、致突變，威脅人類的健康和生存.近年來，不斷有媒體報道在食品如海洋魚類、食品包裝(如嬰兒奶瓶)及地表水中發(fā)現(xiàn)雙酚A，這對人類的食品安全構(gòu)成了極大危害.因此，實現(xiàn)對食品和環(huán)境中雙酚A快速、可靠檢測尤為重要.雙酚A的

檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、液相色譜法、熒光法、極譜法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[2-5].雙酚A具有可電化學(xué)氧化的酚羥基，但其氧化電位高，且易于在電極表面聚合而污染傳感界面[6-7]. 基于酪氨酸酶構(gòu)建的電化學(xué)傳感器能選擇性識別雙酚A，并將酚羥基氧化成醌類化合物，從而靈敏、準(zhǔn)確、快速測定雙酚A[8-9].

圖1 雙酚A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of bispheno1 A

離子液體是由陰、陽離子組成，在100 ℃或低于此溫度下熔融并以此作為特定溫度界限的物質(zhì).具有蒸汽壓低，電化學(xué)穩(wěn)定性好，電導(dǎo)率高，電化學(xué)窗口大等特點[10-11].石墨烯(Graphene)被稱為單層石墨，是由sp2雜化碳原子組成的呈蜂窩狀新型二維原子晶體[12].石墨烯具有許多獨特的物理性能，如比表面積大、高導(dǎo)熱性、室溫下內(nèi)在載流子遷移率高、機械強度好等，廣泛用于能源、材料、生物醫(yī)藥和電化學(xué)傳感等領(lǐng)域[13-18].本文將1,3-二(4-氨基-吡啶)丙烷四氟硼酸鹽離子液體修飾石墨烯修飾至玻碳電極表面，構(gòu)建納米復(fù)合界面，并用于負(fù)載酪氨酸酶以構(gòu)建雙酚A電化學(xué)傳感器.離子液體修飾的石墨烯納米界面不僅增大了酪氨酸酶的負(fù)載量，且能促進(jìn)酶與電極間電子傳遞，提高傳感器的安培響應(yīng)，實現(xiàn)了雙酚A的高選擇性、高靈敏度檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660A電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司;FA2004N電子天平，上海精科；KQ-100E超聲清洗器，昆山市超聲清洗儀器廠；場發(fā)射掃描電子顯微鏡，JEOL-6700F，日本；雙酚A，分析純，阿拉??；磷酸氫二鉀，分析純，汕頭市化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉，分析純，上海新華化工廠；氫氧化鉀，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸酶，Tyrosinase，worthington公司.

1.2 傳感器的制備

玻碳電極(?=3 mm)用氧化鋁懸濁液拋光，并依次在丙酮、乙醇和去離子水中超聲清洗，室溫干燥，備用.用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)配制10.0 g/L酪氨酸酶(Tyr)溶液，取100.0 mL酪氨酸酶溶液(400 units)與100.0 mL，1.0 g/L的Gr-DAPPT溶液超聲混勻，取7.5 μL混合液滴涂至潔凈的玻碳電極表面，4 ℃干燥，經(jīng)戊二醛交聯(lián)，再以去離子水徹底清洗電極表面，除去物理吸附的化學(xué)物質(zhì)，得酪氨酸酶生物傳感器(Gr-DAPPT-Tyr/GCE).

1.3 雙酚A測定

雙酚A測定采用三電極系統(tǒng)：Gr-DAPPT-Tyr/GCE為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極.循環(huán)伏安法電位掃描范圍為-0.3～0.7 V，掃描速度為100 mV/s.在25 mL氧飽和的磷酸緩沖溶液中，以0.1 V作為工作電位實現(xiàn)雙酚A的安培檢測.

1.4 樣品的制備

聚碳酸酯(PC)礦泉水瓶樣品購于附近超市.剪碎后用去離子水清洗，取1.0 g樣品置于50 mL乙醇中，50 ℃加熱12 h，冷卻后密封放置5 d.將混合物過濾，收集濾液，定容，置于冰箱中保存?zhèn)溆?

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

采用掃描電子顯微鏡表征了Gr-DAPPT/GCE(a)和Tyr-Gr-DAPPT/GCE(b)的表面形貌(見圖2).由圖2可以看出，Gr-DAPPT納米復(fù)合物在玻碳電極表面呈現(xiàn)褶皺狀分布，有石墨烯片層結(jié)構(gòu)堆疊現(xiàn)象；Tyr-Gr-DAPPT在玻碳電極表面的形貌迥異，石墨烯的片層結(jié)構(gòu)不再清晰，卻可見許多蠕蟲狀顆粒，為戊二醛交聯(lián)負(fù)載于Gr-DAPPT納米界面上的酪氨酸酶.

圖2 Gr-DAPPT/GCE (a)和 Tyr-Gr-DAPPT/GCE (b)的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of Gr-DAPPT/GCE (a) and Gr-DAPPT-Tyr/GCE (b)

2.2 雙酚A的循環(huán)伏安行為

考察了1.0×10-4mol/L雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE(a)、Tyr-GO-DAPPT/GCE(b)、Gr-Tyr/GCE(c)、Tyr/GCE(d)和GCE(e)上的循環(huán)伏安行為，如圖3所示.除在GCE上無明顯的氧化-還原峰外，其他修飾電極上均呈現(xiàn)出一對明顯的氧化-還原峰，歸屬于雙酚A經(jīng)酪氨酸酶催化氧化后所得醌類化合物的氧化還原反應(yīng).其中，雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的峰電流最大，表現(xiàn)出顯著的增敏效應(yīng).

圖3 1.0×10-4 mol/L雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE (a), Tyr-GO-DAPPT/GCE (b), Tyr-Gr/GCE (c), Tyr/GCE (d)和GCE (e)上的循環(huán)伏安曲線；支持電解質(zhì)： 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)；掃描速度：0.1 mV/s.Fig. 3 Cyclic voltammograms of 1.0 × 10-4 mol/L bisphenol A at the Tyr-Gr-DAPPT/GCE (a), the Tyr-GO-DAPPT/GCE (b), the Tyr-Gr/GCE (c), the Tyr/GCE (d) and the bare GCE (e) Supporting electrolyte: 0.1 mol/L phosphate buffer solution (pH 7.0); Scan rate: 0.1 mV/s.

2.3 實驗條件優(yōu)化

Tyr-Gr-DAPPT溶液的滴涂量不僅影響酪氨酸酶在玻碳電極表面的負(fù)載量，也影響修飾膜厚度，進(jìn)而影響雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的電流響應(yīng).圖3 (a)為Tyr-Gr-DAPPT溶液滴涂量對1.0×10-4mol/L雙酚A的氧化峰峰電流的影響，發(fā)現(xiàn)滴涂量為7.5 μL時，傳感器對雙酚A具有最大的電流響應(yīng)，故選擇7.5 μL 為Tyr-Gr-DAPPT混合溶液的最佳修飾體積.

電化學(xué)測量時，緩沖溶液的pH值會影響酪氨酸酶的活性，進(jìn)而影響雙酚A的電流響應(yīng).在pH值4.0～9.0范圍內(nèi)，考察其對1.0×10-4mol/L雙酚A的氧化峰峰電流的影響，如圖4(b)所示.發(fā)現(xiàn)pH值在4.0 ～ 7.0范圍內(nèi)時，氧化峰峰電流隨pH值增大而增加；在pH值7.0～9.0范圍內(nèi)，氧化峰峰電流隨pH值增加而減小，在pH值7.0時，傳感器對雙酚A的電流響應(yīng)最大，與游離酪氨酸酶活性最大時的pH值一致，表明負(fù)載過程未改變酪氨酸酶的固有性質(zhì).

圖4 滴涂量(a)、pH值(b)及電位(c)對雙酚A電流響應(yīng)的影響Fig. 4 Effects of the volume of Gr-DAPPT-Tyr solution (a), pH values (b) and the applied potential (c) on the peak current response of bisphenol A at the Tyr-Gr-DAPPT/GCE.

安培測定時，電位會影響酪氨酸酶催化雙酚A所得醌類化合物的氧化反應(yīng)，進(jìn)而影響檢測靈敏度.在0～0.2 V范圍內(nèi)，考察安培檢測電位對2.0×10-6mol/L雙酚A的電流響應(yīng)的影響.由圖4(c)可知，檢測電位為0.1 V時，雙酚A的安培響應(yīng)信號最大，靈敏度最高，故選擇0.1 V為最佳安培檢測電位.

2.4 安培法測定雙酚A

圖5 雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培響應(yīng)曲線； 內(nèi)插圖為低濃度時的安培曲線.Fig. 5 The amperometric response of the Tyr-Gr-DAPPT/GCE with successive addition of bisphenol A to 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.0) at an applied potential of 0.1 V. The inset is the amperometric curve of bisphenol A at low concentrations.

優(yōu)化條件下，考察了雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培響應(yīng).如圖5所示，發(fā)現(xiàn)雙酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培響應(yīng)時間很短，安培響應(yīng)電流(I)與雙酚A濃度(c)在1.0 ×10-9～ 3.8×10-5mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為：I(nA ) = 6.99c(μmol/L) + 0.565 2(R=0.999 5)，檢出限是3.5×10-10mol/L (RSN=3).

2.5 重現(xiàn)性與選擇性

以同一Tyr-Gr-DAPPT/GCE連續(xù)測定2.0×10-6mol/L BPA溶液5次，其安培響應(yīng)電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%，具有較好的重現(xiàn)性；分別制備5支Tyr-Gr-DAPPT/GCE，并用于測定2.0×10-6mol/L BPA，其安培響應(yīng)電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%，表明具有良好的制備重現(xiàn)性.采用安培法考察有機小分子對2.0×10-6mol/L雙酚A的干擾情況，發(fā)現(xiàn)1.0×10-4mol/L抗壞血酸、尿酸和半胱氨酸等對雙酚A檢測無干擾.

2.6 實際樣品測定

購買市售某型號太空杯，剪成大約1 cm碎片，洗凈,干燥，稱取28.0 g樣品，置于250 mL圓底燒瓶中，加入乙醇，50 ℃回流反應(yīng)12 h，冷卻至室溫；抽濾，得透明溶液，蒸干溶劑，以少量乙醇溶解，備用.以安培法測定樣品溶液中雙酚A濃度，并采用高效液相色譜和加標(biāo)回收法驗證方法準(zhǔn)確性，如表1所示，結(jié)果表明Tyr-Gr-DAPPT/GCE能夠準(zhǔn)確、可靠測定實際樣品中雙酚A.

表1 實際樣品中雙酚A測定結(jié)果

3 結(jié)論

基于石墨烯-離子液體納米復(fù)合物負(fù)載酪氨酸酶構(gòu)建生物傳感界面，并用于雙酚A的電化學(xué)檢測.結(jié)果表明，石墨烯-離子液體納米復(fù)合物不僅能增加酪氨酸酶的負(fù)載量，且能有效促進(jìn)其對底物的催化效率，實現(xiàn)高靈敏電化學(xué)響應(yīng).該傳感器用于雙酚A安培檢測，具有靈敏度高、重現(xiàn)性、選擇性好等特點，并可實現(xiàn)實際樣品中雙酚A測定.