基于層狀二硫化鉬-石墨烯構(gòu)建新型17β-雌二醇電化學(xué)生物傳感器

駱定法，劉 雪

(信陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

0 引言

17β-雌二醇是一種環(huán)境激素，它會(huì)擾亂人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)人的生殖、成長(zhǎng)和發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響，也會(huì)對(duì)后代的健康帶來(lái)極大的隱患[1]，因此，發(fā)展構(gòu)建用于高靈敏檢測(cè)17β-雌二醇的分析方法十分重要.傳統(tǒng)的用于17β-雌二醇測(cè)定的分析方法包括高效液相色譜 (HPLC) 和氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 聯(lián)用技術(shù)[2-3]，基于適配體的電化學(xué)生物傳感器受到很多研究者的關(guān)注，適配體是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，在生物傳感器中可以為目標(biāo)物的分析提供簡(jiǎn)單快速，且靈敏度高、特異性好的分析平臺(tái)[4-5].

納米材料作為基底材料可以為生物分子提供大的比表面積，為生物分子的固定提供更多的負(fù)載空間，此外還可以加快電子傳遞速率，二者協(xié)同作用可提高傳感器的靈敏度.層狀過(guò)渡金屬二硫化鉬具有和石墨類似的結(jié)構(gòu)，由三個(gè)原子層 (S-W-S) 通過(guò)范德華力堆積而成，具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)、反應(yīng)活性高、催化性能強(qiáng)等特點(diǎn)，使其成為材料科學(xué)研究中的熱點(diǎn)[6-7].但由于其作為一種半導(dǎo)體材料，導(dǎo)電性能相對(duì)較差.本實(shí)驗(yàn)采用一步水熱合成法合成層狀二硫化鉬-石墨烯納米復(fù)合材料(MoS2-Gr)，并結(jié)合金納米作為傳感器制備的基底材料，制備了高靈敏、高選擇性且穩(wěn)定性好的適配體生物傳感器，用于17β-雌二醇的靈敏檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

上海辰華公司生產(chǎn)的CHI 660E電化學(xué)工作站，采用三電極體系，納米材料修飾玻碳電極為工作電極(3 mm直徑)，參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑電極.

1.2 主要試劑

鉬酸鈉、氯金酸、L-半胱胺酸均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；17β-雌二醇、1-氨基蒽醌、萘均購(gòu)買于上海生物工程有限公司.17β-雌二醇適配體序列由上海生物工程有限公司合成，其堿基序列為：

5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT T GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C-3’

17β-雌二醇適配體和17β-雌二醇均溶解于100 mmol/L tris-HCl緩沖液 (pH 8.0，含 200 mmol/L NaCl，25 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2和5% 乙醇).

1.3 二硫化鉬-石墨烯納米復(fù)合材料的制備

首先根據(jù)之前報(bào)道的Hummers[8]方法制備得到氧化石墨，然后再根據(jù)水熱法制備MoS2-Gr復(fù)合材料.具體步驟如下：稱取0.1 g的氧化石墨粉末溶入50 mL的蒸餾水中，超聲攪拌2 h，然后向該溶液中加入0.5 g Na2MoO4并攪拌30 min，再向該混合液中滴加0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，稱取1.0 g L-cysteine加入上述溶液中，稀釋至80 mL后超聲分散1 h.將混合溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的高壓反應(yīng)釜中在180 ℃下恒溫反應(yīng)48 h.反應(yīng)完成后使體系自然冷卻至室溫，抽濾，分別用三重蒸餾水、無(wú)水乙醇各洗滌數(shù)次并于60 ℃下干燥24 h 即可得到MoS2-Gr復(fù)合材料.

1.4 適配體生物傳感器的構(gòu)建

圖1 適配體生物傳感器的制備Fig. 1 The preparation of aptamer biosensor

玻碳電極(GCE)首先依次用粒徑為0.5 μm和0.05 μm的α-Al2O3拋光粉仔細(xì)打磨并拋光成鏡面，并依次用乙醇和蒸餾水超聲清洗干凈，吹干，備用.取1 mg 的MoS2-Gr超聲分散于1 mL的蒸餾水得1 g/L的MoS2-Gr懸浮液.將10.0 μL 1 g/L MoS2-Gr懸浮液滴涂到GCE表面，在室溫下自然晾干后用蒸餾水沖洗，得到MoS2-Gr/GCE修飾電極.然后將該電極浸入含有0.1% HAuCl4的0.1 mol/L KNO3溶液中，利用電沉積法在MoS2-Gr/GCE修飾的玻碳電極表面沉積金納米顆粒，制得MoS2-Gr復(fù)合物和AuNPs修飾的玻碳電極AuNPs/MoS2-Gr/GCE.隨后將8.0 μL 1.0×10-7mol/L的適配體溶液滴加到AuNPs/MoS2-Gr/GCE上，室溫下反應(yīng)過(guò)夜，通過(guò)Au-S鍵共價(jià)鍵和將巰基修飾的適配體修飾到電極表面，反應(yīng)結(jié)束后，再滴加8 μL 1 % 的牛血清白蛋白反應(yīng)約30 min，作為封閉劑減少適配體在電極表面的非特異性吸附.該傳感器的制備過(guò)程如圖1.

1.5 電化學(xué)測(cè)定

在含有0.1 mol/L KCl 的1.0 mmol/L K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6的混合溶液中，用電化學(xué)工作站記錄各修飾電極的循環(huán)伏安曲線(CV)和差分脈沖伏安曲線(DPV).實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：循環(huán)伏安法(CV)：掃描電位區(qū)間為-0.2～+0.6 V，掃速為100 mV/s; 微分脈沖伏安法(DPV)：初始電位為-0.2 V；終止電位為+0.6 V，脈沖寬度為0.02 s，靜置時(shí)間為2 s.交流阻抗法(EIS)：外加恒電位為+0.2 V，激發(fā)振幅為5 mV，頻率范圍0.1～105Hz.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

如圖2A所示，合成的石墨烯為典型的褶皺片層結(jié)構(gòu).圖2B顯示的為MoS2-Gr復(fù)合物的TEM圖，從圖中可以看出，層狀的MoS2堆積在Gr納米片上.

圖2 石墨烯(A)和MoS2-Gr(B)的TEM圖Fig. 2 TEM image of Gr (A) and MoS2-Gr (B)

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)行為

圖3 不同修飾電極在1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-中的CV圖Fig. 3 CVs of different electrodes in 1.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- (a) GCE, (b) MoS2-Gr/GCE, (c) AuNPs/MoS2-Gr/GCE, (d) aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE, (e) BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE

首先通過(guò)CV對(duì)不同修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，如圖3所示，探針[Fe(CN)6]3-/4-在裸GCE(曲線a)上有一對(duì)明顯的氧化還原峰.當(dāng)GCE表面修飾上MoS2-Gr后(曲線b)，其氧化還原峰電流顯著增大，這是由于層狀MoS2-Gr納米復(fù)合材料具有大的比表面積和好的導(dǎo)電性能，有利于電子在電極表面的傳輸.將AuNPs沉積于MoS2-Gr/GCE后(曲線c)，電流達(dá)到最大，說(shuō)明金納米具有很好的導(dǎo)電性，進(jìn)一步促進(jìn)電子在電極上的傳輸，從而增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào)，同時(shí)，AuNPs的引入也是為了下一步aptamer在電極上的固定.當(dāng)aptamer通過(guò)Au-S鍵固定于AuNPs/MoS2-Gr/GCE表面后， [Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰電流明顯減小(曲線d)，這是由于aptamer表面呈電負(fù)性的磷酸骨架與同樣帶負(fù)電的 [Fe(CN)6]3-/4-相互排斥，阻礙其電子傳遞，因此峰電流減小.當(dāng)引入牛血清白蛋白對(duì)電極的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉后，電流進(jìn)一步下降 (曲線e)，這是由于大量的大分子固定于電極表面，其不導(dǎo)電性能及空間位阻阻礙電子傳遞，使得[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰電流更小.這些現(xiàn)象也證明了傳感器的成功構(gòu)建.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

修飾電極上的適配體與目標(biāo)物17β-雌二醇的反應(yīng)受反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響.為了獲得高的檢測(cè)靈敏度，我們對(duì)這兩個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化.

首先考察反應(yīng)溫度的影響.制備了6支BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE，與相同濃度的17β-雌二醇分別在不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃ )下反應(yīng)3 h.然后測(cè)定DPV曲線，結(jié)果表明，隨著反應(yīng)溫度的增大，峰電流逐漸減小，當(dāng)溫度達(dá)37 ℃時(shí)，峰電流達(dá)到最小，再增大反應(yīng)溫度峰電流反而下降.這是因?yàn)楫?dāng)選擇的溫度低于37 ℃ 時(shí)，由于適配體不夠活潑而在電極表面上與雌二醇特異性結(jié)合量變小，而當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，可能是由于適配體過(guò)于活潑，結(jié)合到電極表面后又掉下來(lái)或者是適配體本身的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使得適配體與雌二醇的特異性結(jié)合量降低，因此選擇37 ℃為最佳反應(yīng)溫度.

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間的影響Fig. 4 Effect of reaction time

其次考察了反應(yīng)時(shí)間的影響.制備了7支BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE，與相同濃度的17β-雌二醇在37 ℃下反應(yīng)不同的時(shí)間(1、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h)，然后測(cè)DPV的峰電流，如圖4所示.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間低于3 h時(shí)，可能是由于二者未反應(yīng)完全導(dǎo)致峰電流較大，而反應(yīng)時(shí)間大于3 h的DPV峰電流幾乎不變，這表明當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行3 h 左右時(shí)，電極表面的適配體幾乎全部與17β-雌二醇反應(yīng)，因此即使再延長(zhǎng)雜交時(shí)間，材料表面的17β-雌二醇的量也不會(huì)有太大的變化，峰電流變化非常的微小.故選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h.

2.4 分析性能

適配體的選擇性是適配體生物傳感器有選擇地與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，并排除其他非目標(biāo)物質(zhì)的干擾，即檢測(cè)目標(biāo)的專一性，傳感器的選擇性是其應(yīng)用于實(shí)際中的關(guān)鍵所在.本實(shí)驗(yàn)將適配體生物傳感器分別與17β-雌二醇(a)、萘(b)、1-氨基蒽醌(c)進(jìn)行反應(yīng)，所得結(jié)果如圖5所示.可以看出當(dāng)傳感器與17β-雌二醇反應(yīng)后峰電流最小，而空白溶液的峰電流最大.這說(shuō)明該適配體傳感器能與17β-雌二醇特異性反應(yīng)結(jié)合，具有較好的選擇性.

圖5 生物傳感器與17β-雌二醇、醌、萘反應(yīng)的CV圖Fig. 5 CVs of biosensor reaction with (a) 17β-estradiol, (b) quinone, (c) naphthalene, (d) 空白.

將傳感器BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE與不同濃度的17β-雌二醇在37 ℃下雜交反應(yīng)3 h，然后進(jìn)行DPV測(cè)定，其結(jié)果如圖6所示.隨著17β-雌二醇濃度的增大，峰電流逐漸下降.

圖6 BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE與 不同濃度17β-雌二醇反應(yīng)后的DPV曲線Fig. 6 DPVs of BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE in 1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- after reaction with different concentrations of 17β-雌二醇: (a) 1.0×10-8 mol/L, (b) 5.0×10-9mol/L, (c) 1.0×10-10mol/L, (d) 8.0× 10-11 mol/L, (e) 5.0×10-11 mol/L, (f)1.0×10-11 mol/L，(g) 0.

圖7是測(cè)量所得的峰電流ip與17β-雌二醇濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log c (mol/L))之間的關(guān)系圖.由圖7可以發(fā)現(xiàn)峰電流ip值與17β-雌二醇濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在1.0×10-11mol/L到1.0×10-8mol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.線性方程為：ip(μA)=-19.00+1.878logc(R=0.999 5).通過(guò)空白的三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，可計(jì)算出該方法對(duì)17β-雌二醇濃度的檢出限為5.0×10-12mol/L.

圖7 峰電流與17β-雌二醇濃度的負(fù)對(duì)數(shù)的線性關(guān)系Fig. 7 Linear relationship between peak current and negative logarithm of 17β-estradiol concentration

2.5 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將所制備的適配體生物傳感器 (BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE)用于檢測(cè)1.0×10-10mol/L 的17β-雌二醇，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 [Fe(CN)6]3-/4-中連續(xù)測(cè)定10次后，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%.平行制備7根BSA/aptamer/AuNPs/MoS2-Gr/GCE 用于檢測(cè)同一濃度的17β-雌二醇，其RSD為4.5%.說(shuō)明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性.

3 結(jié)論

本文以MoS2-Gr納米復(fù)合物為基底修飾玻碳電極，然后利用電沉積方法將納米金沉積到MoS2-Gr納米復(fù)合物修飾的玻碳電極表面，構(gòu)建了新型的適配體生物傳感器用于環(huán)境激素17β-雌二醇的檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該適配體生物傳感器不僅具有高的靈敏度，而且具有良好的選擇性.此外，該傳感器重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單，具有較好的應(yīng)用潛力.