弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白16的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

劉原，楊華，吳亮，蘇丹華，付濤，郭雪，劉曼，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，上海200025）

弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白16的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

劉原1，楊華1，吳亮1，蘇丹華1，付濤1，郭雪1，劉曼1，姜旭淦1，陳盛霞1，曹建平2

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，上海200025）

目的：克隆剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子棒狀體蛋白（rhoptry protein，ROP）16基因，并構(gòu)建ROP16基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，檢測(cè)和定位ROP16蛋白的表達(dá)。方法：以弓形蟲(chóng)RH株速殖子基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP16基因，克隆至pET-32a（+）載體，在大腸埃希菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)KCl染色切膠法純化重組ROP16蛋白，并制備其兔多克隆抗體。采用蛋白質(zhì)印跡法和間接免疫熒光法檢測(cè)和定位ROP16在弓形蟲(chóng)速殖子內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果：成功表達(dá)并純化重組ROP16蛋白，制備了其多克隆抗體。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)出相對(duì)分子質(zhì)量為74 000的特異性條帶，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示ROP16分布于弓形蟲(chóng)速殖子胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)論：經(jīng)原核表達(dá)重組ROP16制備的多克隆抗體能檢測(cè)和定位ROP16在弓形蟲(chóng)速殖子內(nèi)的表達(dá)。

剛地弓形蟲(chóng)；棒狀體蛋白16；原核表達(dá)；KCl染色切膠

剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，幾乎可感染包括人類(lèi)在內(nèi)的所有恒溫動(dòng)物。弓形蟲(chóng)感染會(huì)導(dǎo)致孕婦胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎。同時(shí)，作為一種機(jī)會(huì)致病寄生蟲(chóng)，它也是引起艾滋病、惡性腫瘤和器官移植等免疫功能?chē)?yán)重抑制或缺陷患者死亡的原因之一。弓形蟲(chóng)分泌的棒狀體蛋白（rhoptry proteins，ROPs）在其入侵細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用。ROPs主要分布于納蟲(chóng)泡膜、納蟲(chóng)泡內(nèi)和宿主細(xì)胞內(nèi)（細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)）［1］，僅有ROP16和蛋白磷酸酯酶2C（PP2C-Hn）被發(fā)現(xiàn)可以入侵宿主細(xì)胞核。ROP16可通過(guò)影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)傳導(dǎo)途徑，干擾細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等［2］。此外，ROP16屬于ROP2家族成員，是絲氨酸 蘇氨酸激酶，并具有蛋白激酶活性［3］，在弓形蟲(chóng)逃避宿主免疫應(yīng)答中起重要的作用［4］。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)弓形蟲(chóng)ROP16原核表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)弓形蟲(chóng)ROP16進(jìn)行原核表達(dá)，制備其多克隆抗體，檢測(cè)并定位ROP16在弓形蟲(chóng)速殖子中的表達(dá)，為深入研究ROP16的功能及闡明弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株、細(xì)胞株、菌株、載體和動(dòng)物

剛地弓形蟲(chóng)RH株速殖子由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系徐大剛教授提供，液氮中長(zhǎng)期保存。將我室長(zhǎng)期保存在液氮中的人包皮成纖維（HFF）細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。原核表達(dá)載體pET-32a（+）及大腸埃希菌（E.coil）DH5α株和Rosetta（DE3）株為本室保存。pTG19-T載體購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。雄性新西蘭兔，約2.0 kg，購(gòu)自江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ、Xho I和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（立陶宛Fermentas公司）；質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型）、GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、2×PCR預(yù)混液、牛血清白蛋白購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher（中國(guó)）有限公司；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG（FITCIgG）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（HRP-IgG）和硝酸纖維素膜購(gòu)自武漢博士德公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑（美國(guó)Sigma公司）；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。全自動(dòng)凝膠成像儀及垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

1.3 DNA的提取

參照文獻(xiàn)［5］的方法體外培養(yǎng)弓形蟲(chóng)速殖子于HFF細(xì)胞中，鏡下觀察到蟲(chóng)體脹破80%～90%細(xì)胞，并可見(jiàn)蟲(chóng)體游離于細(xì)胞外時(shí)，收集蟲(chóng)體。按試劑盒操作說(shuō)明提取弓形蟲(chóng)速殖子基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)基因庫(kù)中顯示的弓形蟲(chóng)RH株速殖子基因組ROP16的基因序列（登錄號(hào)GQ249080.1），利用DNAStar引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物ROP16-F：5′-GGCGAATTCATGAAAGTGACCACGAAAGGGCTT-3′（下劃線(xiàn)為EcoRⅠ酶切部分），下游引物ROP16-R：5′-GGCCTCGAGCATCCGATGTGAAGAAAGTTCGGTAG-3′（下劃線(xiàn)為Xho I酶切部分），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以速殖子基因組DNA為模板，擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP16編碼基因。PCR反應(yīng)體系：PCRGreen Mix 25μL，上游引物和下游引物各2μL，模板DNA 4μL，滅菌蒸餾水17μL，總體積為50μL。反應(yīng)條件：94℃10 s（熱啟動(dòng)）；94℃5 s，56.8℃60 s，72℃2 min，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并純化。

1.5 ROP16/pET32a表達(dá)載體的構(gòu)建

將目的基因片段與載體pTG19-T連接，構(gòu)建pTG19-T-ROP16載體。將pTG19-T-ROP16轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐西林篩選、PCR擴(kuò)增及BamHⅠ酶切鑒定，測(cè)序分析陽(yáng)性克隆。將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒以限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收ROP16基因片段，通過(guò)T4連接酶與pET32a連接，構(gòu)建pET32a-ROP16表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)氨芐西林篩選及酶切鑒定陽(yáng)性克隆。

1.6 重組ROP16在Rosetta菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組ROP16陽(yáng)性克隆質(zhì)粒導(dǎo)入Rosetta感受態(tài)菌中。取培養(yǎng)12 h的陽(yáng)性克隆菌液200μL，按1∶100比例加入含氨芐西林的20 mL LB培養(yǎng)基中。當(dāng)光密度值［D（600 nm）］達(dá)到0.6左右，將上述菌液加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別于2，4，6，8，10 h收集菌體，取5μL離心后樣本上清液進(jìn)行SDS-PAGE分離，并根據(jù)電泳結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.7 重組ROP16蛋白的純化

按最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體沉淀，加入PBS并重懸混勻，取冰上超聲裂解后上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)果顯示目的蛋白在包涵體中。故在剩余菌體沉淀中，按每100 mL菌液加入4mL包涵體結(jié)合緩沖液，超聲裂解后取上清液，采用Ni-NTA親和純化柱純化蛋白，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)無(wú)目的條帶，蛋白未能純化。故采用KCl染色切膠法純化目的蛋白［6］。大量表達(dá)重組蛋白R(shí)OP16，收集菌體沉淀并用包涵體洗滌緩沖液充分洗滌除去雜蛋白，經(jīng)包涵體結(jié)合緩沖液變性、超聲裂解等處理后得到上清液，SDS-PAGE電泳后，用1 mol/L預(yù)冷的KCl溶液染色5 min，對(duì)照考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，可見(jiàn)1條明顯的目的條帶。將目的蛋白條帶切下，置于EP管中，-70℃保存。

1.8 重組ROP16蛋白多克隆抗體制備

取出-70℃保存的膠條，每根膠條加1mL弗氏佐劑研磨至肉眼無(wú)可見(jiàn)顆粒為止，于背部皮下注射免疫新西蘭兔，首次免疫使用弗氏完全佐劑研磨，分別于初次免疫后第21天、28天和35天使用弗氏不完全佐劑研磨膠條并加強(qiáng)免疫新西蘭兔。于最后一次免疫前抽取兔耳緣靜脈血，當(dāng)ELISA法檢測(cè)的血清抗體效價(jià)＞1∶51 200時(shí)，終止免疫，心臟采血，4 000 r/ min離心20 min，將血清保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ROP16的表達(dá)

將弓形蟲(chóng)RH株培養(yǎng)于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HFF細(xì)胞中，鏡下觀察蟲(chóng)體脹破80%～90%細(xì)胞，并可見(jiàn)蟲(chóng)體游離于細(xì)胞外時(shí)，收集蟲(chóng)體，以HFF細(xì)胞作為陰性對(duì)照。用10μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液將蟲(chóng)體及細(xì)胞沉淀重懸，煮沸5 min，4℃、16 400 r/ min離心10 min。取上清液5μL加樣進(jìn)行SDSPAGE電泳，將目的蛋白于150 mA、80 min條件下轉(zhuǎn)印到NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉30 min，將制備的多克隆抗體（1∶200）作為一抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次；將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次后加入ECL顯色，觀察結(jié)果。

1.10 間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)ROP16的分布

無(wú)菌條件下于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中間放置1個(gè)蓋玻片，加入適量含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，2.5×105個(gè)/孔接種HFF細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)，1×106個(gè)/孔接種弓形蟲(chóng)RH株，輕搖混勻后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后移除培養(yǎng)液，加入2 mL 4%低聚甲醛室溫固定10 min，吸去低聚甲醛后加入2 mL 0.25%TritonX-100透化10 min，5%BSA室溫封閉2 h。滴加兔抗重組ROP16蛋白抗血清（1∶200）室溫孵育1 h，用PBS緩沖液洗滌3次；滴加FITC-IgG（1∶50）室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3次；取2μL DAPI至3 mL PBS緩沖液中，染色10 min后再用PBS緩沖液洗滌3次；封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光在蟲(chóng)體內(nèi)的分布。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲(chóng)ROP16基因的PCR擴(kuò)增

以弓形蟲(chóng)基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，獲得2 121 bp片段（圖1），與弓形蟲(chóng)ROP16理論長(zhǎng)度相符。

圖1 PCR擴(kuò)增弓形蟲(chóng)ROP16基因

2.2 ROP16/pET32a重組質(zhì)粒的鑒定

將ROP16/pET32a重組質(zhì)粒進(jìn)行Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約為5 422 bp和2 121 bp的兩條片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明ROP16被完整插入到pET32a（+）載體中。

圖2 ROP16/pET32a（+）重組質(zhì)粒Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切結(jié)果

2.3 重組蛋白的鑒定與純化

誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量99 800處出現(xiàn)1條蛋白表達(dá)條帶（圖3），與重組質(zhì)粒理論蛋白分子質(zhì)量相符。將KCl染色切膠法純化獲得的膠條與PBS混合，研磨至沒(méi)有顆粒，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見(jiàn)純化的蛋白回收條帶（圖3）。

圖3 弓形蟲(chóng)ROP16重組蛋白的表達(dá)與純化

2.4 弓形蟲(chóng)ROP16蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為74 000的條帶可被兔抗重組ROP16蛋白多克隆抗血清識(shí)別（圖4），與重組ROP16蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小相符。由此可以證明KCl染色切膠純化法制備的兔抗多克隆抗體具有較高的免疫反應(yīng)活性。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)弓形蟲(chóng)ROP16蛋白的表達(dá)

2.5 IFA檢測(cè)弓形蟲(chóng)ROP16的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)ROP16蛋白的綠色熒光分布于弓形蟲(chóng)速殖子胞質(zhì)內(nèi)，位于細(xì)胞核前端，與棒狀體位置相符（圖5）。

圖5 弓形蟲(chóng)ROP16蛋白的分布（IFA×1 000）

3 討論

棒狀體是僅在頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的一種專(zhuān)性分泌器官，其分泌的蛋白直接進(jìn)入宿主細(xì)胞，發(fā)揮各自的功能。弓形蟲(chóng)棒狀體分泌的蛋白改變宿主細(xì)胞的很多正常生理功能，從而感染大范圍的宿主物種和細(xì)胞種類(lèi)［7］。目前已鑒定出9種棒狀體蛋白［8］，而唯一能入侵宿主細(xì)胞核的只有ROP16。不同弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株間ROP16基因序列呈多態(tài)性［9］，ROP16因其特殊的功能和在宿主細(xì)胞內(nèi)的定位，成為宿主和弓形蟲(chóng)之間相互作用的關(guān)鍵因子［10-11］。

本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)、黏性末端雙酶切、體外定向克隆、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、篩選鑒定、蛋白免疫印跡、間接免疫熒光等方法，對(duì)ROP16進(jìn)行原核表達(dá)，成功制備了重組ROP16兔多克隆抗體，并檢測(cè)到ROP16在弓形蟲(chóng)RH株速殖子中的表達(dá)和分布，為后續(xù)研究ROP16的生物學(xué)功能及其在弓形蟲(chóng)致病中的作用提供了技術(shù)支持。

目的蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)形式分為兩種：一是非可溶性的包涵體顆粒，二是可溶性的蛋白質(zhì)。本研究中ROP16/pET32a（+）重組蛋白以包涵體形式存在，未能用Ni-NTA親和純化法獲得目的蛋白，原因可能是擬表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大或空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其His標(biāo)簽可能會(huì)被包裹在蛋白內(nèi)，無(wú)法與鎳柱結(jié)合，難以通過(guò)鎳螯合層析法純化［12］。于是我們采用染色切膠法獲取目的蛋白，該方法首先要選取一個(gè)合適的染料，不僅能將目的蛋白短時(shí)間內(nèi)顯現(xiàn)出來(lái)，而且還不能破壞其結(jié)構(gòu)。通常采用的考馬斯亮藍(lán)R-250染色方法會(huì)使蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)受到影響［13］，于在江等［14］用NaAc染色切膠的方法成功純化了目的蛋白，但因電泳、染色等過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，使用受到限制。與NaAc染色切膠法相比，KCl染色切膠法具有如下優(yōu)點(diǎn)：①更加高效，獲取的目的蛋白可反復(fù)凍融，且不會(huì)導(dǎo)致濃度和純度的改變；②試劑成本低，性?xún)r(jià)比高［15］。

本研究采用IFA技術(shù)，以重組ROP16蛋白制備的多抗，在弓形蟲(chóng)速殖子入侵的宿主細(xì)胞核內(nèi)未能檢測(cè)出ROP16的分布，與已有的研究報(bào)道不一致［11，16］，可能是制備的多抗特異性沒(méi)有單抗強(qiáng)。下一步我們將構(gòu)建帶有Myc標(biāo)簽的ROP16突變株，用Myc單抗來(lái)檢測(cè)ROP16蛋白在宿主細(xì)胞核內(nèi)的分布。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of rhoptry protein 16 from Toxoplasma gondii

LIU Yuan1，YANG Hua1，WU Liang1，SU Dan-hua1，F(xiàn)U Tao1，GUO Xue1，LIU Man1，JIANG Xu-gan1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-pin2
（1.School ofMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To clone and construct a recombinant expression plasmid of rhoptry protein（ROP）16 from tachyzoites of Toxoplasma gondii（T.gondii）RH strain in Escherichia coli，and to determine and locate the expression of ROP 16 in tachyzoites.M ethods：The ROP16 gene was amplified from genomic DNA of T.gondii RH strain and cloned into the plasmid pET-32a（+）.The expression of the recombinant pET32a-ROP16 was induced in E.coli Rosetta strain，and ROP16 was purified by cutting the gel sliceswith KCl stain.The anti-ROP16 polyclonal antibody was produced in rabbit，and ROP16 in tachyzoiteswas analyzed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay（IFA）respectively.Results：The recombinant plasmid pET32a-ROP16 was successfully expressed and purified，and the anti-ROP16 polyclonal antibody was obtained.The 74 000 specific band of ROP16 was detected by Western blotting，and the ROP16 was distributed in the cytoplasm of tachyzoites by IFA.Conclusion：The anti-ROP16 polyclonal antibody prepared by recombinant ROP16 can detectand locate the expression of ROP16 in tachyzoites of T.gondii.

Toxoplasma gondii；ROP16；prokaryotic expression；KCl stain

R382.5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號(hào)］ 1671-7783（2015）03-0251-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140296

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81301453）；衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（WSBKTKT201302）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M561598）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1402171C）；江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（13JDG023，13JDG127）

劉原（1991—），女，碩士研究生；陳盛霞（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：chensxia@ujs.edu.cn

2014-11-15 ［編輯］陳海林