大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來源的外切體抑制順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡

祝源，楊芳，張嬌，薛建國，尹磊，俞靜，賈浩源，紀(jì)成，錢暉

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來源的外切體抑制順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡

祝源，楊芳，張嬌，薛建國，尹磊，俞靜，賈浩源，紀(jì)成，錢暉

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：觀察大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源的外切體（exosome）對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法：原代培養(yǎng)大鼠骨髓MSC并提取外切體鑒定。構(gòu)建順鉑損傷NRK-52E細(xì)胞模型，損傷組為5μmol/L順鉑處理6 h后正常營養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，處理組為順鉑損傷后以100μg/mL外切體共培養(yǎng)48 h。未經(jīng)任何處理的NRK-52E細(xì)胞為對照組。TUNEL-FITC，凋亡雙染流式細(xì)胞術(shù)，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：與對照組比較，損傷組NRK-52E細(xì)胞腫大，胞核不規(guī)則樣改變，凋亡細(xì)胞增多，凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)而Bcl-2下調(diào)；處理組NRK-52E細(xì)胞腫大較損傷組緩解，胞核形態(tài)改善，凋亡細(xì)胞減少，Bax下調(diào)且Bcl-2上調(diào)。結(jié)論：大鼠骨髓MSC來源的外切體對順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。

外切體；順鉑；腎小管上皮細(xì)胞；損傷；凋亡

間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干細(xì)胞療法中重要的種子細(xì)胞，在腎損傷修復(fù)中有較好的應(yīng)用前景［1］，研究證實(shí)其旁分泌的因子，如內(nèi)皮生長因子在MSC損傷修復(fù)中起重要作用［2］。近年來，MSC分泌的外切體作為旁分泌中最有活性的成分以及細(xì)胞間信息傳遞的重要載體，已成為組織再生修復(fù)的新熱點(diǎn)［3］。本課題組前期研究也表明，人臍帶MSC來源的外切體（hucMSC-ex）對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷有治療作用［4］，且對深Ⅱ度皮膚燒傷和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化也有修復(fù)效果［5-6］。在此基礎(chǔ)上，本研究擬分離純化大鼠骨髓MSC來源的外切體，并觀察其對順鉑誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，以期為MSC來源外切體的深入研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E（中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫）；順鉑（中國德州制藥有限公司），胎牛血清、H-DMEM（Invitrogen公司），TUNEL-FITC試劑盒（Vazyme公司），DAPI染料（Beyotime公司），Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司），外切體提取試劑盒（System Biosciences公司，貨號EXOQ5A-1），兔抗鼠Bax、Bcl-2（Bioworld公司），抗GAPDH鼠單克隆抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)志的羊抗鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體（Cwbio公司），預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物（Millipore公司）；Forma CO2培養(yǎng)箱（Scientific公司），Ti-S熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），LM10-HBST納米顆粒分析儀［NanoSight（NTA）公司］，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司），ImageQuantLAS4000mini凝膠成像分析儀（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 外切體的分離鑒定 選取健康4周齡SD雄鼠，無菌環(huán)境下以PBS盥洗股骨骨髓腔，腔液經(jīng)離心后重懸于營養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。傳至第4代進(jìn)行干細(xì)胞鑒定［7］并收集培養(yǎng)上清，按照說明書分離上清中的外切體，利用納米顆粒分析儀及蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行鑒定。

1.2.2 順鉑損傷細(xì)胞模型構(gòu)建及外切體共培養(yǎng)用含5%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)胰蛋白酶消化后，以每孔7×104個(gè)細(xì)胞于6孔板中繼續(xù)貼壁培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，對照組：NRK-52E細(xì)胞不經(jīng)任何處理；損傷組：NRK-52E細(xì)胞經(jīng)5μmol/L順鉑處理6 h后，換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；處理組：5μmol/L順鉑刺激NRK-52E細(xì)胞6 h后，換含有100μg/mL外切體的常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 TUNEL-FITC檢測各組細(xì)胞的凋亡 用4%低聚甲醛溶液固定各組NRK-52E細(xì)胞，然后按照說明書操作，PBS清洗，2%Triton X-100室溫孵育5 min，PBS清洗，1×平衡緩沖液室溫孵育30 min，再用TdT孵育緩沖液37℃避光孵育60 min。PBS洗滌后，DAPI避光染色5 min，熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.4 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化、收集各組NRK-52E細(xì)胞，冰PBS洗滌1次，100μL 1×Annexin結(jié)合緩沖液重懸，加入5μL Alexa Fluor 488 Annexin V和1μL 100μg/mL PI試劑室溫孵育15 min，加入400μL 1×Annexin結(jié)合緩沖液，輕混后置于冰上，避光，上流式細(xì)胞儀，設(shè)定的激發(fā)光波長分別為530 nm和575 nm。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

收集各組NRK-52E細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞裂解液充分裂解，按照4∶1的體積加入5×上樣緩沖液，沸水煮10 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移所有蛋白至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，以Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，HRP標(biāo)記的抗鼠/兔（1∶5 000）抗體稀釋液37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，配置預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行凝膠成像分析。GAPDH作為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Prism 5.0軟件進(jìn)行直方圖繪制及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外切體分離與鑒定

分離的大鼠骨髓MSC來源的外切體經(jīng)納米分析儀檢測，結(jié)果顯示，獲得的顆粒直徑平均值為91 nm，眾數(shù)為68 nm，D10為46 nm，D50為78 nm，D90為149 nm，證實(shí)為外切體（圖1）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對照組常規(guī)培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞的形態(tài)為鵝卵石典型上皮樣細(xì)胞，而損傷組NRK-52E細(xì)胞在鏡下可見細(xì)胞明顯腫大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，出現(xiàn)大小不一空泡，細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少，但處理組細(xì)胞腫大現(xiàn)象有所改善，細(xì)胞數(shù)量較損傷組增多（圖2）。

圖1 大鼠骨髓MSC來源的外切體鑒定

2.3 TUNEL-FITC檢測細(xì)胞凋亡

熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組比較，損傷組凋亡細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞核呈不規(guī)則樣改變，表明順鉑促進(jìn)細(xì)胞凋亡；處理組凋亡細(xì)胞較損傷組減少，同時(shí)細(xì)胞核形態(tài)相對規(guī)則，提示外切體削弱了順鉑的促凋亡作用。見圖3。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，與對照組比較，損傷組發(fā)生晚期凋亡的細(xì)胞比例明顯增高，而處理組則較損傷組明顯降低（P＜0.001）；處理組早期凋亡細(xì)胞比例較對照組和損傷組明顯降低（P均＜0.001）。由此可見，順鉑能誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞凋亡，且以早期凋亡為主，而外切體處理后，細(xì)胞凋亡明顯減少，尤以早期凋亡明顯（圖4）。

圖2 各組細(xì)胞的形態(tài)（×200）

圖3 TUNEL-FITC檢測各組細(xì)胞的凋亡（×200）

圖4 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

2.5 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

結(jié)果表明，損傷組NRK-52E細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)較對照組明顯增加，而Bcl-2表達(dá)明顯減少。處理組Bax表達(dá)較損傷組下降，而Bcl-2表達(dá)增加，定量分析結(jié)果與其一致（圖5）。

3 討論

外切體是一種膜型囊泡樣結(jié)構(gòu)，能夠運(yùn)載多種蛋白質(zhì)、RNA等具有生物活性成分的物質(zhì)從而完成細(xì)胞間信號傳遞［8］。研究表明，完整的MSC來源的外切體可以通過增加ATP含量，減少氧化應(yīng)激，活化PI3K/Akt信號通路，恢復(fù)小鼠缺血再灌注后心肌的生物學(xué)功能［9］。也有研究顯示人的MSC來源的微囊泡可有效修復(fù)大腸埃希菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，一定程度上是由于微囊泡攜帶角質(zhì)細(xì)胞生長因子的mRNA至受損肺泡所致［10］。

圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人臍帶MSC來源的外切體（hucMSC-ex）通過抑制由順鉑誘導(dǎo)的p38-MAPK通路活化而促進(jìn)的細(xì)胞凋亡，從而減弱順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性腎氧化損傷［4］。另外，hucMSC-ex通過攜帶Wnt4分子，活化燙傷組織中β-catenin信號通路，從而促進(jìn)深Ⅱ度燒傷的修復(fù)［5］。在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中，hucMSC-ex通過抑制肝臟細(xì)胞上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)換（EMT）改變，減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原以及TGF-1β和p-Smad2的表達(dá)，以達(dá)到減輕纖維化并保護(hù)肝臟的作用［6］。大鼠骨髓MSC來源豐富，培養(yǎng)相對便捷；MSC對組織器官損傷的修復(fù)作用是通過分泌的外切體完成的。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠骨髓MSC來源的外切體對順鉑誘導(dǎo)的大鼠的腎小管上皮細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)，并探討其機(jī)制。

本研究鑒定并確認(rèn)了提取的大鼠骨髓MSC來源外切體。在此基礎(chǔ)上成功建立了順鉑誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞急性損傷模型，并初步證明，提取的外切體在一定程度上能減弱順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡。順鉑刺激引起的腎小管上皮細(xì)胞腫大及細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則樣改變等情況，在與外切體共培養(yǎng)后有明顯改善，同時(shí)凋亡細(xì)胞也減少。順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)而Bcl-2下調(diào)的現(xiàn)象也在外切體處理后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。本研究說明，外切體在削弱順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，主要是通過減少早期凋亡細(xì)胞完成的，但是外切體抑制細(xì)胞早期凋亡的機(jī)制及相關(guān)通路有待闡明。

研究表明，外切體中的miRNAs協(xié)同作用可緩解缺氧引起的心肌損傷［11］，而且藥物改造后的外切體能更好地發(fā)揮藥效［12］。已有報(bào)道稱miRNAs與細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)，這些研究結(jié)果將為我們下一步研究提供依據(jù)和啟發(fā)。

綜上所述，本研究表明，大鼠骨髓MSC來源的外切體能減弱順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞急性損傷，進(jìn)一步減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，尤其是早期凋亡。

［1］ T?gel FE，Westenfelder C.Mesenchymal stem cells：a new therapeutic tool for AKI［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6（3）：179-183.

［2］ Li D，Wang N，Zhang L，etal.Mesenchymal stem cells protect podocytes from apoptosis induced by high glucose via secretion of epithelial growth factor［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4（5）：103.

［3］ Camussi G，Deregibus MC，Bruno S，et al.Exosomes/ microvesicles as amechanism of cell-to-cell communication［J］.Kidney Int，2010，78（9）：838-848.

［4］ Zhou Y，Xu H，XuW，etal.Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4（2）：34.

［5］ Zhang B，Wang M，Gong A，et al.hucMSC-exosome mediated-Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing［J］.Stem Cells，2014.［Epub ahead of print］.

［6］ Li T，Yan Y，Wang B，et al.Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis［J］.Stem Cells Dev，2013，22（6）：845-854.

［7］ 孫曉春，姚堃，許文榮，等.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，13（4）：289-291.

［8］ Février B，Raposo G.Exosomes：endosomal-derived vesicles shipping extracellularmessages［J］.Curr Opin Cell Biol，2004，16（4）：415-421.

［9］ Arslan F，Lai RC，Smeets MB，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels，decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhancemyocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Stem Cell Res，2013，10（3）：301-312.

［10］ Zhu YG，F(xiàn)eng XM，Abbott J，et al.Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coli endotoxin-induced acute lung injury in mice［J］.Stem Cells，2014，32（1）：116-125.

［11］ Gray WD，F(xiàn)rench KM，Ghosh-Choudhary S，et al.I-dentification of therapeutic covariantmicroRNA clusters in hypoxia-treated cardiac progenitor cell exosomes using systems biology［J］.Circ Res，2015，116（2）：255-263.

［12］ Sun D，Zhuang X，Xiang X，et al.A novel nanoparticle drug delivery system：the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes［J］.Mol Ther，2010，18（9）：1606-1614.

Exosome derived from rat bonemarrow mesenchymal stem cells inhibits the apoptosis in cisplatin-induced renal proximal tubular epithelial cells

ZHU Yuan，YANG Fang，ZHANG Jiao，XUE Jian-guo，YIN Lei，YU Jing，JIAHao-yuan，JICheng，QIAN Hui
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of exosome derived from rat bonemarrow mesenchymal stem cells on the apoptosis of cisplatin-induced renal proximal tubular epithelial cells.M ethods：Primitive rat bonemarrow mesenchymal stem cellswere separated and cultured in vitro from which exosome were extracted and proofed.The injury of NRK-52E cellswas induced by 5μmol/L cisplatin for 6 h and cultured for another 48 h using normal DMEM.100μg/mL exosome contained DMEM was used in restoration group for the 48 h after the cisplatin treatment，and normal NRK-52E cells with no treatment were used as control.TUNEL-FITC，flow cytometry and immunoblotting were used to detect the apoptosis in each group.Results：Compared with the control group，NRK-52E cells in cisplatin group grew into swollen ones with nucleus changed irregularly，the number of apoptotic cellswas increased；the expression of apoptosis associated protein Bax was upregulated while Bcl-2 downregulated.However，in the exosome group，the phenomenon of swell and irregular nucleus in NRK-52E cellswas alleviated.The number of apoptotic cellswas decreased，with decreased expression of Bax and increased expression of Bcl-2.ConclusionExosome derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells could suppress the apoptosis induced by cisplatin in NRK-52E cells.

exosome；cisplatin；renal proximal tubular epithelial cell；injury；apoptosis

祝源（1990—），女，碩士研究生；錢暉（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：lstmmmlst@163.com

R329.25 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0203-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150047

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272481）；江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目［蘇教科（2013）10號］；江蘇省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（LJ201117）；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310299058Y）

2015-03-17 ［編輯］ 劉星星