RNAi雙沉默Survivin和hTERT基因抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡

肖 琳，王 平，董俊紅，王守訓(xùn)，劉順梅

(濰坊醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室， 山東 濰坊 261042)

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研究論文

RNAi雙沉默Survivin和hTERT基因抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡

肖 琳，王 平，董俊紅，王守訓(xùn)*，劉順梅

(濰坊醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室， 山東 濰坊 261042)

目的探討雙向沉默Survivin和hTERT基因?qū)Y(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為結(jié)腸癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄shRNA并可分別及聯(lián)合干擾Survivin和hTERT分子表達(dá)的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后, 分陰性對(duì)照組、空白質(zhì)粒對(duì)照組、 Survivin RNAi組、hTERT RNAi組和Survivin-hTERT RNAi組。轉(zhuǎn)染48h后 TRAP-PCR-ELISA 法檢測(cè)端粒酶活性，RT-PCR 法檢測(cè)Survivin和hTERT mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)Survivin和 hTERT蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀及cck-8法分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果Survivin-hTERT RNAi組SW480細(xì)胞端粒酶活性明顯下降(P<0.01)，Survivin-hTERT RNAi組Survivin及hTERT的mRNA水平較正常對(duì)照組分別減低82.8%和73.6%(P<0.01)，蛋白表達(dá)抑制率分別為79.2%和66.7%(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)各組中Survivin-hTERT RNAi組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率最高，分別為43.6%±0.1%和39.2%±2.3%(P<0.01)。結(jié)論Survivin和hTERT雙干擾質(zhì)粒可明顯下調(diào)Survivin和hTERT蛋白的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

RNA干擾；Survivin；hTERT；結(jié)腸癌

結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)是比較常見的消化道惡性腫瘤，也是主要的致死性疾病之一，在歐美國家，結(jié)腸癌在惡性腫瘤死亡原因中排第2位[1- 2]。而在中國，在人們飲食結(jié)構(gòu)改變、高度的工作、精神壓力以及空氣環(huán)境污染等多種因素的作用下，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升。同時(shí)結(jié)腸癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果差，因此本研究選取Survivin和hTERT這兩個(gè)跟結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的兩個(gè)基因用RNAi的方式以探討如何更好的治療結(jié)腸癌。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的重要成員之一，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及腫瘤血管的形成中都發(fā)揮著重要的作用[3]。端粒酶已被公認(rèn)為已知的最廣譜的腫瘤標(biāo)志物之一，在多種腫瘤中均有不同程度的表達(dá)[4]。本研究同時(shí)沉默Survivin和hTERT基因, 探討其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系(上海細(xì)胞庫)，L-15培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)，Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)，PCR-TRAT-ELISA端粒酶活性檢測(cè)試劑盒、FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche公司)，質(zhì)粒pGenesil- 1.2(武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司)，Survivin和hTERT單克隆抗體(CST公司)，中量質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，CCK- 8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：Survivin(NM_001168)與hTERT(NM_198253)基因序列來自GenBank，分別設(shè)計(jì)3組干擾序列，預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出高效、特異性強(qiáng)的一組干擾序列，Survivin的靶向干擾序列為5′-GGACCACCGCATCTCTACA-3′，hTERT的靶向干擾序列為5′-AAGAACGTGCTGGCCTTCG-3′，經(jīng)Blast分析證明與人類其他編碼序列無同源性。將合成的shRNA退火片段分別與pGenesil- 1.1和pGenesil- 1.2線性化載體連接，分別構(gòu)建pGenesil- 1.1-Survivin、pGenesil- 1.2-hTERT單干擾載體和pGenesil1.1-Survivin-hTERT雙干擾載體，經(jīng)酶切鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建成功[5]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480培養(yǎng)于L15培養(yǎng)液，添加10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素，在37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁增殖，待細(xì)胞覆蓋瓶底至70%～80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)增殖期的SW480細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1 d,用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù), 用血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至3×105/mL，鋪板在12孔板中，每孔加入0.5 mL。分組轉(zhuǎn)染(FuGENE HD∶DNA=2∶1),實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、空白質(zhì)粒對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pGenesil- 1.1空質(zhì)粒)，Survivin RNAi組(轉(zhuǎn)染pGenesil- 1.1-Survivin)、hTERT RNAi組(轉(zhuǎn)染pGenesil- 1.2-hTERT)和Survivin-hTERT RNAi組(轉(zhuǎn)染pGenesil1.1- Survivin-hTERT)，放置于37 ℃，5% CO2孵育箱中孵育24～48 h，轉(zhuǎn)染過程按FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 半定量RT-PCR法檢測(cè)各組Survivin及hTERTmRNA：待細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，按說明書用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。參照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，以管家基因GAPDHmRNA作為內(nèi)參照。引物序列如下：GAPDH 5′-ATG GCACCGTCAAGGCTGAG-3′(上游引物)，5′-GCAGT GATGGCATGGACTGT-3′(下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物約379 bp。Survivin：5′-GACAGATGAAGGTTGGG-3′(上游引物)，5′-AGGTGGATGAGGAGACAGA-3′(下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物約228 bp。hTERT：5′-TCATCGCCAG CATCATCAAAC-3′(上游引物)，5′-ATGTACGGCTG GAGGTCTGTCA-3′(下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物約136 bp。反應(yīng)結(jié)束后分別取各組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，Bio-1D凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)Survivin和hTERT蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔取40 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗人Survivin單抗1∶1 000稀釋；鼠抗人hTERT單抗1∶500稀釋；鼠抗人β-actin單抗1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS洗膜，分別加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶20 000鼠抗兔IgG)，室溫孵育2 h，PBS洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)處理、曝光、顯影，對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=A目標(biāo)蛋白/Aβ-actin。抑制率= (1-轉(zhuǎn)染組目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量/空白對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量)×100%。

1.2.6 TRAP-ELISA法測(cè)定細(xì)胞端粒酶活性：轉(zhuǎn)染后48 h后，收集各組細(xì)胞方法采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(telomeric repeat am-plification protocol-enzyme linked immunosor-bentassay，TRAP-ELISA)法，每組取約5×106個(gè)細(xì)胞，加入裂解液，提取細(xì)胞的核蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取待測(cè)樣品50 μg，按照PCR-TRAT-ELISA試劑盒的說明進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各組450 nm和690 nm波長處的吸光度(A)值。每孔A值=A450 nm-A690 nm。

1.2.7 CCK- 8測(cè)定SW480細(xì)胞增殖抑制率：取對(duì)數(shù)增殖期的SW480細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為空白調(diào)零對(duì)照組(不含細(xì)胞)、空白對(duì)照組、空白質(zhì)粒對(duì)照組、Survivin RNAi組、hTERT RNAi組、Survivin-hTERT RNAi組，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入CCK- 8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀用450 nm波長測(cè)吸光度值(A值)。取8 孔平均值，計(jì)算抑制率。細(xì)胞抑制率IR(100%)=[1-(干擾組A值-空白調(diào)零對(duì)照組A值)/(空白對(duì)照組A值-空白調(diào)零對(duì)照組A值)]×100%。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染后48 h，將各組細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化收集, 用PBS及緩沖液各洗滌細(xì)胞1次，離心后每組收集5×106個(gè)細(xì)胞，加入100 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加5 μL Annexin V-APC混勻，再加入5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex=633 nm； Em=670 nm)細(xì)胞凋亡的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 mRNA水平表達(dá)

與空白對(duì)照組、空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，各干擾組mRNA相對(duì)表達(dá)量均有降低，其中雙干擾組的SurvivinmRNA和hTERTmRNA表達(dá)水平下調(diào)最明顯，相對(duì)含量明顯降低(P< 0.01)，其表達(dá)受到明顯的抑制(圖1，表1)，雙干擾組的mRNA表達(dá)抑制率為82.8%(Survivin)和73.6%(hTERT) (P<0.05)。

M.DL2000 marker；1.blank group；2.blank Plasmid control group；3.hTERT RNAi group；4.Survivin RNAi group；5.Survivin-hTERT RNAi group圖1 各組hTERT mRNA和Survivin mRNA表達(dá)電泳圖Fig 1 Electrophoregram of hTERT and Survivin mRNA level in various groups

Table 1 hTERT and Survivin mRNA expression

groupSurvivinmRNAhTERTmRNAblankgroup 093±003 087±001blankPlasmidcontrolgroup 094±004 089±003hTERTRNAigroup 043±006? 037±008?SurvivinRNAigroup 027±004?? 056±001?Survivin?hTERTRNAigroup 016±007?? 023±005??

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank group.

2.2 Western blot法檢測(cè)蛋白水平表達(dá)

與空白對(duì)照組、空白質(zhì)粒對(duì)照組相比，各干擾組Survivin蛋白和hTERT蛋白表達(dá)均有下調(diào)，其中雙干擾組的Survivin蛋白和hTERT蛋白水平下調(diào)最為明顯，相對(duì)含量有明顯的降低(P<0.01)，表達(dá)水平受到明顯抑制(圖2，表2)。雙干擾組的蛋白表達(dá)抑制率為79.2%(Survivin)和66.7%(hTERT)。

1.blank group；2.blank plasmid control group；3.hTERT RNAi group；4.Survivin RNAi group；5.Survivin-hTERT RNAi group圖2 hTERT蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)Fig 2 Survivin and hTERT protein expression

2.3 端粒酶活性測(cè)定結(jié)果

TRAP-PCR ELISA檢測(cè)的結(jié)果顯示各干擾組端粒酶活性均有降低(表3)，其中hTERT RNAi組和Survivin-hTERT RNAi組的端粒酶活性降低明顯。

表2 各組Survivin蛋白和hTERT蛋白表達(dá)相對(duì)含量

groupSurvivinproteinhTERTproteinblankgroup 105±009 081±002blankPlasmidcontrolgroup 108±003 082±001hTERTRNAigroup 079±007 031±006?SurvivinRNAigroup 035±004?? 062±002?Survivin?hTERTRNAigroup 022±004?? 027±007??

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank group.

2.4 細(xì)胞增殖抑制作用

采用CCK- 8法檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較Survivin-hTERT RNAi組、Survivin RNAi組和hTERT RNAi組細(xì)胞增殖均受到明顯抑制(表3)，其中Survivin-hTERT RNAi組抑制增殖效果最明顯(P<0.01)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，各干擾組早期凋亡率均高于晚期凋亡率(圖3)，與空白對(duì)照組比較Survivin-hTERT RNAi組、Survivin RNAi組和hTERT RNAi組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，其中Survivin-hTERT RNAi組凋亡率最高(表3)。

3 討論

目前結(jié)腸癌的治療手段主要依靠手術(shù)和化療放療，但是療效并不能令人滿意，因此尋找一種基因治療位點(diǎn)，可以為結(jié)腸癌的治療提供理論依據(jù)。

Survivin蛋白是凋亡IAPs家族成員之一，在對(duì)大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白在正常大腸上皮細(xì)胞中不表達(dá)，其表達(dá)發(fā)生在大腸腺癌惡性轉(zhuǎn)化的早期，在癌變過程中起重要作用[6]。結(jié)腸癌中Survivin的表達(dá)62.9%陽性， 癌旁正常組織均無表達(dá)[7]。有多項(xiàng)研究表明，Survivin的表達(dá)上調(diào)與腫瘤凋亡指數(shù)下降、轉(zhuǎn)移率增高、總體存活率縮短、預(yù)后不良和復(fù)發(fā)率增加有關(guān)[8]。

表3 各組端粒酶活性，細(xì)胞增值抑制率和細(xì)胞凋亡率

Table 3 The telomerase activity，the inhibitory rate of cell proliferation and the cell apoptosis rate

grouptelomeraseactivityinhibitoryrateofcellproliferation(%)cellapoptosisrate(%)blankgroup 1773±0014-- 311±05blankplasmidcontrolgroup 1766±0039-- 234±03hTERTRNAigroup 0844±0013? 314±02? 196±16?SurvivinRNAigroup 1291±0022 253±02? 250±04?Survivin?hTERTRNAigroup 0689±0042?? 436±01?? 392±23??

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank group.

A.blank group；B.blank plasmid control group；C.hTERT RNAi group；D.Survivin RNAi group；E.Survivin-hTERT RNAi group

端粒酶全酶由端粒酶 RNA(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase related protein，TPI)和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse tran-scriptase，hTERT) 3部分組成，hTR和TPI在正常組織和腫瘤組織均有表達(dá)，與端粒酶活性無相關(guān)性，而hTERT作為端粒酶的催化亞基組分，具有反轉(zhuǎn)錄功能，即以端粒酶自身攜帶的RNA組分為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，其表達(dá)對(duì)端粒酶激活是必需的，是端粒酶激活的限速步驟[9- 10]。有研究表明hTERT在結(jié)腸癌中高表達(dá)，陽性表達(dá)率達(dá)80.8%，并且其表達(dá)與端粒酶活性及結(jié)腸癌的分期、病理生物學(xué)行為密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12- 13]靶向hTERT mRNA的siRNA可有效抑制前列腺癌、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程一般至少有兩個(gè)或者兩個(gè)以上功能不同、異常激活的基因共同發(fā)揮作用，因此本研究選取了兩個(gè)與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的兩個(gè)基因Survivin和hTERT，用RNAi的方式將其沉默，探尋更好治療結(jié)腸癌的方法。結(jié)果顯示分別沉默兩基因的單干擾組在抑制細(xì)胞生長增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及減少蛋白表達(dá)方面作用程度相當(dāng)，而雙干擾組Survivin-hTERT RNAi組與單干擾組相比抑制蛋白表達(dá)作用更強(qiáng)，細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均明顯升高，而Survivin-hTERT RNAi組的端粒酶活性比hTERT RNAi組有一定程度的降低。這說明兩基因在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中存在某種協(xié)同或互補(bǔ)作用，同時(shí)沉默Survivin和hTERT兩個(gè)基因可以更好地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，為臨床治療結(jié)腸癌提供了新的理論基礎(chǔ)。而如果將該技術(shù)應(yīng)用于臨床，以及Survivin和hTERT兩個(gè)基因之間的相互協(xié)同促進(jìn)作用到底通過哪些信號(hào)途徑起作用有待于進(jìn)一步的研究。

[1] JemalA, SiegelR, Xu J,etal.Cancer statistics[J].CACancer JClin, 2010, 60:277- 300.

[2] Ferlay J，Autier P，Boniol M，etal.Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in[J].Ann Oncol, 2007, 18:581- 592.

[3] Ambrosini G，Adida C，Alteri DC. A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma [J].Nat Med,1997,3:917- 921.

[4] Donate LE，Blasco MA. Telomeres in cancer and ageing,[J] Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2011,366:76- 84.

[5] 王 平，肖 琳,董俊紅,等. survivin和hTERT雙靶點(diǎn)表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2013, 33:1440- 1445.

[6] Lin LJ, Zheng CQ, Jin Y, Ma Yetal.Expression of survivin protein in human colorectal carcinogenesis[J].World J Gastroenterol, 2003, 9:974- 977.

[7] 毛銀玲，徐剛，孟凡玲,等.P-STAT5和Survivin在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國腫瘤臨床,2011,38:716- 717.

[8] Pavlidou A, Dalamaga M, Kroupis C,etal.Survivin isforms and clinicopathological characteristics in colorectal adenocarcinomas using real-times qPCR [J].World J Gastroenterol, 2011,17:1614- 1621.

[9] Counter CM, Meyerson M, Eaton EN,etal.Telomerase activity is restored in human cells by ectopic expression of hTERT hEST2，the catalytic submit of telomerase[J].Oncogene, 1998, 16:12- 17.

[10] Polanská E, Dob áková Z, Dvo á ková M,etal.HMGB1 gene knockout in mouse embryonic fibroblasts results in reduced telomerase activity and telomere dysfunction [J].2012,Apr 28. [Epub ahead of print].[J].Chromosoma, 2012, 121:419- 431.

[11] 趙敏.hTERT和P53在結(jié)腸癌中表達(dá)及意義[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2011,14:793- 795.

[12] 王 建，何志巍. 靶向hTERT的小干擾 RNA誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中國腫瘤，2012,21:211- 214.

[13] 宋玉姣，韓繼波,陳始明,等. 腺病毒介導(dǎo)的shRNA沉默hTERT基因表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].腫瘤防治研究, 2011, 38:1351- 1355.

新聞點(diǎn)擊

單獨(dú)雌激素療法對(duì)50～55歲停經(jīng)女性認(rèn)知功能退化無改善作用

據(jù)美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(PNAS)網(wǎng)站2013-06-26報(bào)道，去年美國服務(wù)工作小組(USPSTF)回顧多項(xiàng)大型研究后指出，使用激素療法可能增加女性中風(fēng)、癡呆癥、深部靜脈血栓、膽囊疾病及尿失禁的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此不應(yīng)用來預(yù)防慢性疾病。

先前美國國家老化研究院(National Institute on Aging)所做婦女健康計(jì)劃記憶研究(WHIMS)也已指出，65歲以上年老女性服用單獨(dú)雌激素療法，將增加認(rèn)知功能缺陷及癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)提高的危險(xiǎn)。而這次該研究團(tuán)隊(duì)則希望了解在較年輕的停經(jīng)女性身上使用是否也會(huì)出現(xiàn)同樣的結(jié)果。

研究參與者為1 326位女性，自50～55歲開始使用激素療法長達(dá)7年的時(shí)間，停止使用后再過7.2年，研究以電話訪談1 168位女性，了解并評(píng)估她們的語文記憶、注意力、執(zhí)行能力、語文流暢度及工作記憶的程度，兩次評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)是在參與者平均67.2～68.1歲時(shí)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服用激素療法與安慰劑的兩組在這些能力上的評(píng)分上并沒有出現(xiàn)顯著的差異，也就是說，年輕停經(jīng)女性服用較短時(shí)間的雌激素療法，長期來看可能不會(huì)提高對(duì)她們認(rèn)知功能的傷害，但研究同樣也并未發(fā)現(xiàn)有任何對(duì)退化改善的好處。

這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)與早先的一項(xiàng)研究認(rèn)為“服用激素替代療法的婦女在她們60幾歲時(shí)會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知能力下降”的結(jié)論相駁。

由于激素替代療法會(huì)帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)，包括增加患乳腺癌的幾率等，所以在采用激素替代療法時(shí)應(yīng)因人而異，應(yīng)在分析個(gè)案的基礎(chǔ)上有針對(duì)性地進(jìn)行治療。如在開始進(jìn)行激素替代療法時(shí)應(yīng)嘗試用最小劑量，用最短的時(shí)間。

該研究刊載于2013-06-24的美國醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)科醫(yī)學(xué)期刊(JAMA Internal Medicine)。

RNAi-silencedSurvivinandhTERTgene inhibits proliferation and induces apoptosis of human colorectal carcinoma cell line SW480

XIAO Lin, WANG Ping, DONG Jun-hong,WANG Shou-xun*, LIU Shun-mei

(Dept. of Biochemistry, Preclinical Medicine, Weifang Medical College，Weifang 261042, China)

Objective To investigate the Influence ofSurvivinandhTERTgene on cell proliferation and apoptosis in human colorectal carcinoma cell line SW480 and to find experiment evidence for gene therapy of colorectal carcinoma. Methods Plasmids carrying shRNAs targetingsurvivinandhTERTwere designed, constructed and transfected into SW480 cells. SW480 cells were then divided into blank group, blank Plasmid control group, survivin RNAi group, hTERT RNAi group and Survivin-hTERT RNAi group. The telomerase activity was examined by TRAP-PCR-ELISA analysis 48h after hTERT-shRNA transfection．SurvivinandhTERTmRNA and protein expression was analyzed by RT-PCR and Western blot. Cell apoptosis, proliferation were measured by flow cytometry, CCK-8 assay. Results Telomerase activity of SW480 cells in Survivin-hTERT RNAi groups were significantly

decreased compared with the blank group(P<0.01). The expression ofsurvivinandhTERTmRNA, proteins in the Survivin-hTERT RNAi group was reduced by 82.8% and 73.6%(P<0.01)，79.2% and 66.7% (P<0.01)respectively. The inhibitory rate of cell proliferation of Survivin-hTERT RNAi group was 43.6%±0.1%(P<0.01). The apoptosis rate was 39.2%±2.3%(P<0.01) in the Survivin-hTERT RNAi group. Conclusions The Survivin-hTERT RNAi group could significantly reduces the protein expression ofsurvivinandhTERTmRNA, inhibit cell proliferation and induces cell apoptosis in human colorectal carcinoma cell line SW480.

RNA interference;Survivin;hTERT; colorectal carcinoma

2014- 04- 21

2014- 07- 18

山東省自然科學(xué)基金 (ZR2010HM065，ZR2010DM010)；濰坊市科技局項(xiàng)目(20121227，201301062)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(J14LK57)

1001-6325(2015)01-0038-06

R318.14

A

*通信作者(corresponding author)：linnihao@sina.com