白細(xì)胞介素18基因工程表達(dá)方法

喬友軍 汪 欣 高 杰 王 寶 賈春祎 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 3006)

白細(xì)胞介素(IL)-18是一種新型具有多態(tài)性的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，以前稱干擾素(IFN)-γ誘導(dǎo)因子〔1〕。IL-18具有抗多種病毒、抗細(xì)菌、真菌的功能〔2〕;其對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫及NK細(xì)胞免疫均有相應(yīng)的生物學(xué)作用。IL-18可直接誘導(dǎo)NK細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌 IFN-γ〔3〕，IFN-γ 不抑制 B 細(xì)胞的分泌，但可抑制B細(xì)胞生成IgE、IgG，對(duì)IgG2d高表達(dá)〔4〕。IL-18通過(guò)增進(jìn)分泌IL-10，使腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性增加〔5〕，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。當(dāng)NK細(xì)胞與腫瘤靶細(xì)胞結(jié)合后開(kāi)始相互作用，隨即啟動(dòng)細(xì)胞死亡信號(hào)，最終細(xì)胞DNA的斷裂致使細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑儀器 DNA MARKER:寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒:天根生化科技有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱:GSP-9270型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含有pGEX-IL-18重組體質(zhì)粒的E.coli JM109菌復(fù)蘇－80℃冰箱取E.coli JM109菌凍存管1支，立即放入37℃水浴箱中，待完全融化后在生物安全柜內(nèi)以無(wú)菌程序?qū)M109菌液接種于50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，觀察菌液生長(zhǎng)情況，供質(zhì)粒提取使用。

1.2.2 質(zhì)粒提取 柱平衡后，集菌5 ml，12 000 r/min離心1 min，吸棄上清液。向離心管中加入P1 250 μl，用渦旋振蕩器徹底使細(xì)菌沉淀懸浮。向離心管中加入P2 250 μl，顛倒混勻6次。向離心管中加入 P3 350 μl后，顛倒混勻 6次，再12 000 r/min離心10 min后會(huì)有沉淀形成。收集上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。向吸附柱CP3中加入漂洗液PW 600 μl，再12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。先將吸附柱CP3放入收集管中，再12 000 r/min離心2 min。向吸附膜的中間滴加洗脫緩沖液EB 60 μl，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中備用。該質(zhì)粒為pGEX-IL-18，并經(jīng)過(guò)測(cè)序和基因庫(kù)比對(duì)證實(shí)。

1.2.3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的質(zhì)粒 配制1%瓊脂糖凝膠后，放入電泳槽中。將樣品與6×DNA上樣緩沖液混合，并將樣品混合液反復(fù)吹打混和均勻，加入到凝膠的加樣孔內(nèi)，再加入 DNA Marker 2 μl。電泳儀開(kāi)啟，電壓 100 V，電流90 mA，時(shí)間為30 min，最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠成像儀觀察照相。

1.2.4 轉(zhuǎn)化 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)菌內(nèi)，制備表達(dá)IL-18的細(xì)胞。組質(zhì)粒 pGEX-IL-18具備表達(dá) IL-18的功能，轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)菌內(nèi)，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，即可得到表達(dá)的IL-18。

1.2.4.1 受體菌的培養(yǎng) 將甘油貯存的受體菌DH5α在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)20 h。挑取2 mm大小的單菌落接種于1 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖過(guò)夜。取上述菌液200 μl轉(zhuǎn)入50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 300 r/min，振蕩培養(yǎng)2.5 h，使細(xì)胞的濃度達(dá)5×107個(gè)/ml，此時(shí)細(xì)菌的OD260一般在0.2～0.4之間。

1.2.4.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備 將培養(yǎng)的菌液冰上放置10 min，然后轉(zhuǎn)移離心管中，4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上，使剩余的液體流盡。加入10 ml預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2使沉淀輕輕懸浮，然后冰浴15 min。此時(shí)為感受態(tài)細(xì)胞。將上述菌液4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，每50 ml的原培養(yǎng)物加入2 ml冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，再加終濃度為10%的滅菌甘油，按每份200 μl分裝在Ep管中，置－70℃凍貯。

1.2.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌細(xì)胞內(nèi) 把感受態(tài)細(xì)胞各200 μl分別加入實(shí)驗(yàn)管、陽(yáng)性管、陰性管中;連接產(chǎn)物(100～500)加入實(shí)驗(yàn)管10 μl;已知質(zhì)粒DNA(10)加入陽(yáng)性管10 μl;無(wú)菌水加入陰性管10 μl后42℃ 90 s后迅速置冰浴3～5 min;再分別在實(shí)驗(yàn)管、陽(yáng)性管、陰性管中加入SOC培養(yǎng)基各800 μl;37℃振搖培養(yǎng)45～90 min。

1.2.4.4 藍(lán)白篩選陽(yáng)性重組體 取含100 μg/ml氨芐青霉素的LB平板，在板面上涂布IPTG試劑和X-gal試劑。將200 μl上述培養(yǎng)物，以玻璃涂布棒輕輕地平鋪于瓊脂平板表面。將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。觀察藍(lán)白菌落，白色為陽(yáng)性重組體。

2 結(jié)果

質(zhì)粒提取瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒大小為2.7 kb，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果為IL-18基因片段，見(jiàn)圖2。重組體插入基因片段生物信息比對(duì)顯示，插入片段長(zhǎng)度和順序與目的基因相符，見(jiàn)圖3。藍(lán)白篩選與抗性篩選一同使用，篩選結(jié)果:未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長(zhǎng);轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落;轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長(zhǎng)成白色菌落。

圖1 pGEX-IL-18重組體質(zhì)粒電泳結(jié)果

圖2 IL-18基因片段測(cè)序結(jié)果

圖3 重組體插入基因片段生物信息比對(duì)截圖

3 討論

IL-18是腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)它實(shí)為免疫調(diào)節(jié)因子可殺傷或抑制腫瘤生長(zhǎng)并在腫瘤免疫方面發(fā)揮了極其重要的作用。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤患者IL-18水平在有轉(zhuǎn)移患者比無(wú)轉(zhuǎn)移患者和對(duì)照組有顯著性增高，從而說(shuō)明IL-18水平的變化可能反映了人體對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御程度。IL-18對(duì)免疫細(xì)胞有多項(xiàng)免疫調(diào)節(jié)功能，這個(gè)細(xì)胞因子極大潛在的抗腫瘤能力。因此IL-18在腫瘤基因治療方面具有潛在的發(fā)展空間，其在基礎(chǔ)領(lǐng)域和應(yīng)用領(lǐng)域都有了嶄新的發(fā)展。如何利用基因工程表達(dá)來(lái)制備IL-18將是未來(lái)的趨勢(shì)。

本研究探討了基因工程制備IL-18的實(shí)驗(yàn)條件，為制備IL-18提供實(shí)驗(yàn)保障。下一步工作將是制備純化IL-18的實(shí)驗(yàn)研究，將這個(gè)質(zhì)粒重組體轉(zhuǎn)移到具有高效表達(dá)功能的DH5α宿主菌中進(jìn)行目的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)探討可通過(guò)GST標(biāo)簽親和層析純化目的蛋白的條件?；贗L-18具有重要抗腫瘤等多種的生物學(xué)功能，將對(duì)IL-18進(jìn)行后續(xù)的科研工作系統(tǒng)研究。

1 Nakamura K，Okamura H，Nagata K，et al.Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma int erferon production〔J〕.Infect Immun，1993;61(1):64.

2 Zhang T，Kawakami K，Qureshi MH，et al.Inteleukin-12(IL-12)and IL-18 synergistrically induce the fungicidal activity of murine peritoneal exudate cells against cryptococcus neoformans through production of gamma interferon by natural killer cells〔J〕.Infect Immunol，1997;65(9):3594-9.

3 Greene CM，Meachery G，Taggart C，et al.Role of IL-18 in CD4 T lymphocyte activation in Sarcoidosis〔J〕.J Immunol，2000;165(8):4718-24.

4 Born TL，Morrison LA，Esteban DJ，et al.A poxvirus protein that binds toand inactivates IL-18 and inhibit s NK cell response〔J〕.J Immunol，2000;164(6):3246-54.

5 Cardon GE，Lindemann MJ，Baiocchi R，et al.The functional characterization of interlukin-10 receptor expression on human natural killer cells〔J〕.Blood，1995;8512:3577-85.