轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3在哮喘模型大鼠肺組織中的表達(dá)及歸喘寧滴丸的干預(yù)作用

王志旺 孫少伯 郭 玫 程小麗 朱 冉 藺興遙 王瑞瓊(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

中藥當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica Sinensis(oliv.)Diels干燥根，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功能，主治血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、腸燥便秘等癥，自古一直被中醫(yī)廣泛用于多種疾病的治療，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸治療哮喘自古就有記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《本草圖經(jīng)》以及《慎齋醫(yī)書》等著作中都有當(dāng)歸治療哮喘的理論與臨床應(yīng)用，如《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載當(dāng)歸“為補(bǔ)血活血要藥，故主咳逆上氣也”。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油對豚鼠離體痙攣狀態(tài)氣管平滑肌有明顯的解痙作用〔1〕，本次實(shí)驗(yàn)以哮喘大鼠行為學(xué)、肺組織T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平以及肺組織病理學(xué)等為研究指標(biāo)，探討歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠的平喘作用。

1 材料與方法

1.1 動物、受試劑及儀器 雌性SD大鼠，體質(zhì)量115～145 g，SPF級，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2004-0006。甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，普通飲食及飲水。歸喘寧滴丸，甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥化學(xué)研究室提供;醋酸地塞米松片，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H33020822，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號:111068;卵清白蛋白(OVA)，Grade V，Sigma公司產(chǎn)品;吐溫-80，上海大眾制藥廠，生產(chǎn)批號:70093;抗體T-bet、抗體GATA-3購于美國Santa Cruz公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用0.8%吐溫-80配制歸喘寧滴丸(按當(dāng)歸揮發(fā)油計(jì)算:1.6%、0.8%、0.4%)與地塞米松(0.005%)乳狀液，另配制0.8%吐溫-80的空白對照液，冷藏備用。420AI超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司生產(chǎn);TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;BS1103型Sartorius電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物篩選 將大鼠放于自制的密閉玻璃箱內(nèi)，超聲霧化0.5%磷酸組胺生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、前肢縮抬、點(diǎn)頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為實(shí)驗(yàn)用大鼠。

1.2.2 分組、造模與給藥 取篩選合格雌性大鼠〔2〕54只，按體重分層隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型對照組、地塞米松組、當(dāng)歸喘寧滴丸高、中、低劑量組，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食去OVA的特殊飼料和水。致敏時(shí)，除正常對照組外，各組于第1天、第8天用新鮮配制的OVA 50 mg(5%)與含100 mg(10%)氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液共1 ml，在大鼠兩后足跖、兩側(cè)腹股溝做皮下注射，每點(diǎn)0.2 ml，同時(shí)腹腔注射0.2 ml;正常對照組以生理鹽水代替致敏。第15天開始激發(fā)，即將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)(40 cm×30 cm×20 cm)，用超聲霧化器以霧化量0.8 ml/min霧化吸入 1%OVA的生理鹽水，每次20 min，1次/d，連續(xù)28 d;正常對照組以生理鹽水代替激發(fā)。激發(fā)前1 h，各組大鼠按10 ml/kg灌胃給藥，即歸喘寧滴丸高、中、低劑量組灌胃歸喘寧滴丸160、80、40 mg/kg(以當(dāng)歸揮發(fā)油計(jì)算)，地塞米松組灌胃地塞米松0.5 mg/kg，正常對照組與模型對照組灌胃空白對照液;1次/d，連續(xù)28 d。

1.2.3 支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn) 分別于實(shí)驗(yàn)的第28天和第42天進(jìn)行。用1%OVA激發(fā)液霧化吸入(霧化參數(shù)與激發(fā)相同)20 min，觀察15 min內(nèi)大鼠的反應(yīng)并記錄評分，評分原則參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行〔3，4〕，記錄大鼠打噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)與哮喘程度，觀察藥物的平喘作用。具體計(jì)分方法是:大鼠沒有出現(xiàn)噴嚏計(jì)為0分，出現(xiàn)1～5個噴嚏計(jì)為1分，出現(xiàn)6～10個噴嚏計(jì)為2分，噴嚏＞11個計(jì)為3分;沒有抓鼻計(jì)為0分;抓鼻1～5個計(jì)為1分，抓鼻6～10個計(jì)為2分，抓鼻＞11個計(jì)為3分;無喘息癥狀計(jì)為0分，有輕度喘息(躁動或靜伏)計(jì)為3分，明顯喘息(呼吸困難，腹式呼吸、呼吸急促呈點(diǎn)頭狀但幅度較小、迅速抬頭做喘息狀)計(jì)為6分，嚴(yán)重喘息(呼吸極度困難，呼吸急促呈點(diǎn)頭狀幅度大頻率高或反應(yīng)遲鈍)或致死計(jì)為9分。

1.2.4 Western印跡法測定肺組織中T-bet與GATA-3的蛋白表達(dá)水平 大鼠最后一次激發(fā)24 h后，股靜脈采血處死，打開胸腔，于固定位置取未經(jīng)灌洗的左肺組織100 mg，加入600 μl裂解液，經(jīng)冰上勻漿、超聲、靜置后4℃離心(15 000 r/min)15 min，取上清液用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白并加入等體積的上樣緩沖液(100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷酸鹽pH值6.8，200 ml/L甘油，0.2 g/L溴酚藍(lán)，20 g/L十二烷基硫酸鈉，200 mmol/L二硫蘇糖醇)，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，分別與小鼠抗大鼠 T-bet、GATA-3鼠抗體(1∶500)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，小鼠抗大鼠β-actin鼠抗體(1∶2 000)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG抗體(1∶4 000)同樣室溫溫育2 h。應(yīng)用發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，將顯帶的X線片經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理，比較T-bet、GATA-3與β-actin的相對吸光度值，進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 肺組織病理變化 取大鼠未經(jīng)灌洗的左肺組織，10%甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，參考文獻(xiàn)〔3，4〕，在光學(xué)顯微鏡下對上皮細(xì)胞脫落程度與肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度觀察并進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學(xué)的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠在支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)中的行為綜合評分值顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較，歸喘寧滴丸各給藥組大鼠在激發(fā)實(shí)驗(yàn)中的行為綜合評分值顯著減小(P＜0.01)。見表1。

2.2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平的影響 經(jīng)Western印跡法分析顯示，在蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為62 000、50 000和45 000處有表達(dá)條帶，分別是T-bet、GATA-3與β-actin蛋白表達(dá)。經(jīng)半定量分析可知，T-bet蛋白在哮喘模型對照組大鼠肺組織中低表達(dá)，經(jīng)歸喘寧滴丸治療后，其表達(dá)水平明顯提高(P＜0.01);GATA-3蛋白在模型對照組大鼠肺組織中高表達(dá)，經(jīng)80～160 mg/kg劑量范圍內(nèi)的歸喘寧滴丸治療后，表達(dá)水平顯著降低。見圖1、表2。

2.3 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠肺組織病理改變的影響如圖2所示，正常對照組大鼠肺組織經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下炎癥表現(xiàn)不甚明顯，而模型對照組大鼠肺組織可見明顯的炎癥反應(yīng):支氣管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，基底膜增生、變厚，支氣管壁充血、水腫并有大量嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;各給藥組亦存在不同程度的上皮細(xì)胞脫落、支氣管壁充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)，但較模型對照組明顯減輕。同時(shí)，對大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析，表3與表4結(jié)果顯示，模型對照組與正常對照組比較，大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤程度明顯較重(P＜0.01)，各給藥組上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤程度有不同程度的減輕，平均級數(shù)有所下降，其中歸喘寧滴丸高劑量組與模型對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學(xué)的影響(±s)

表1 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠造模過程中行為學(xué)的影響(±s)

與模型對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

評分正常對照組 9 2.3±1.82) 9 2.8±0.42)組別 第28天n 評分第42天n模型對照組 9 8.2±2.4 9 9.9±3.0地塞米松組 9 1.9±1.12) 8 1.9±0.42)歸喘寧滴丸高劑分組 9 4.1±1.42) 9 4.3±0.72)歸喘寧滴丸中滴分組 9 4.6±2.12) 8 4.6±1.32)歸喘寧滴丸低劑分組 9 5.1±2.02) 9 5.4±1.02)

圖1 大鼠肺組織T-bet、GATA-3蛋白表達(dá)的Western印跡法分析

表2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平的影響(±s)

表2 歸喘寧滴丸對哮喘大鼠肺組織中T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)水平的影響(±s)

T-bet GATA-3正常對照組 9 0.698±0.2572) 1.280±0.4022)組別 n模型對照組 9 0.266±0.073 2.891±0.858地塞米松組 8 0.643±0.2292) 1.424±0.3782)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0.638±0.2162) 1.457±0.4822)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0.532±0.2352) 1.620±0.4952)歸喘寧滴丸低劑量組 9 0.446±0.2021)2.170±0.607

圖2 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠肺臟病理的影響(HE，×20)

表3 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度的影響(±s)

表3 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度的影響(±s)

組別 n 支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度(n)－R值+平均級數(shù)(95%可信區(qū)間)正常對照組 9 7 2 0 0 0.22 0.09±0.192)模型對照組 9 0 0 5 4 2.44 0.79±0.19地塞米松組 8 0 5 3 0 1.38 0.41±0.201)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0 4 5 0 1.56 0.48±0.191)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0 3 4 1 1.75 0.54±0.20歸喘寧滴丸低劑量組902432.11 0.66±0.19

表4 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度的影響(±s)

表4 歸喘寧滴丸對實(shí)驗(yàn)性哮喘大鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度的影響(±s)

組別 n 支氣管壁上皮細(xì)胞浸潤程度(n)－R值+平均級數(shù)(95%可信區(qū)間)正常對照組 9 8 1 0 0 0.11 0.07±0.192)模型對照組 9 0 0 6 3 2.33 0.78±0.19地塞米松組 8 0 6 2 0 1.25 0.38±0.201)歸喘寧滴丸高劑量組 9 0 5 4 0 1.44 0.46±0.191)歸喘寧滴丸中劑量組 8 0 3 5 0 1.63 0.53±0.20歸喘寧滴丸低劑量組902522.00 0.66±0.19

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，是一種由T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。近20年來盡管已經(jīng)采取包括吸入糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的綜合抗炎治療方案，但流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病率、死亡率并沒有隨之而降低〔5〕，仍然迫切需要去尋找新的方法來防治哮喘。當(dāng)歸是常用中藥之一，傳統(tǒng)理論認(rèn)為當(dāng)歸和血、行血、補(bǔ)血，“和血而降氣、暢血而行氣”，“故主咳逆上氣”。當(dāng)歸主要含有揮發(fā)油和水溶性成分，其中揮發(fā)油被認(rèn)為是治療哮喘的主要有效部位，臨床研究顯示，用當(dāng)歸揮發(fā)油丸治療哮喘24例，總有效率可達(dá)90.2%〔6〕;以當(dāng)歸揮發(fā)油為主要有效成分的當(dāng)歸喘痛寧治療喘息型支氣管炎及支氣管哮喘61例，有效率為81.2%〔7〕。豚鼠離體氣管平滑肌實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油及其中性非酚性部位能舒張豚鼠離體氣管平滑肌，對抗組胺、乙酰膽堿所致豚鼠離體氣管平滑肌的痙攣性收縮作用〔1〕。在OVA霧化致敏過程中，觀察大鼠打噴嚏、抓鼻甚至哮喘樣癥狀并進(jìn)行計(jì)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示歸喘寧滴丸能明顯減小大鼠在激發(fā)過程中的行為綜合評分;肺組織病理顯示，歸喘寧滴丸可減輕支氣管上皮細(xì)胞脫落、支氣管壁充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)，對支氣管壁上皮細(xì)胞脫落程度與炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析，160 mg/kg的歸喘寧滴丸可明顯減輕上述病理指標(biāo)。

1986年，Mosmann根據(jù)分泌細(xì)胞因子譜及其功能的不同，將CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2兩種亞群，近30年來，該分類方法形成了理解CD4+T免疫作用機(jī)制的框架，也形成了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，即以Th2占優(yōu)勢的Th1與Th2細(xì)胞及其相關(guān)因子的免疫失衡是哮喘的主要原因〔8〕。T-bet與 GATA-3是Th1與Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。T-bet是Th1細(xì)胞發(fā)育的主要開關(guān)，通過IFN-γ-STAT1(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1)信號使其表達(dá)增加，活化的T-bet能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN-γ等Th1類細(xì)胞因子而抑制Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生;GATA-3僅在Th2細(xì)胞中表達(dá)，通過IL-4/STAT6信號使GATA-3表達(dá)增加，活化的GATA-3進(jìn)入胞核，上調(diào)Th2類細(xì)胞因子表達(dá)，從而促進(jìn)Th2分化，抑制Th1分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，歸喘寧滴丸可明顯促進(jìn)肺組織T-bet蛋白的表達(dá)而抑制GATA-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)T-bet/GATA-3免疫平衡，這也是歸喘寧滴丸平喘的作用機(jī)制之一。

1 吳國泰，任 遠(yuǎn)，王 鋒，等.當(dāng)歸揮發(fā)油不同部位對豚鼠離體氣管平滑肌的作用及機(jī)制研究〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011;28(4):1-4.

2 劉中成，張艷芬.一種大鼠慢性哮喘模型的建立與評價(jià)〔J〕.藥效學(xué)報(bào)，2010;45(6):718-23.

3 劉建文，季 光.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:136-41.

4 王力寧，李志峰，陳平蘭，等.六味地黃顆粒對哮喘大鼠血清NO及肺組織NOS水平影響的研究〔J〕.廣西中醫(yī)藥，2011;34(1):47-52.

5 蘇奎國，姜良鐸，郭勇英，等.桑蘇飲對哮喘模型大鼠氣道重塑及肺組織上皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響〔J〕.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;34(4):354-7.

6 王鎖才，彭長福，唐敏章，等.當(dāng)歸揮發(fā)油丸對支氣管哮喘止喘作用的臨床觀察〔J〕.天津中醫(yī)，1986;(1):4-5.

7 馬 慧，董惠蕓.當(dāng)歸喘痛寧治療喘息型支氣管炎及支氣管哮喘療效觀察〔J〕.甘肅中醫(yī)，1998;11(4):17.

8 陳培麗，王申東，畢銘陽，等.麥芪益肺合劑對哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影響及安全性研究〔J〕.中國藥房，2010;21(39):3669-71.