促紅細(xì)胞生成素對阿爾茨海默病模型大鼠記憶能力及其超微結(jié)構(gòu)的影響

李宜培 彭蕤蕤 柴高尚 靳 力 王 黎

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理生理學(xué)教研室，河南 鄭州 451191)

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆最常見的類型〔1〕，其主要病理學(xué)特征為神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為主的老年斑(SP)〔2，3〕、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化的 tau蛋白聚集為核心構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)〔4〕以及皮質(zhì)、海馬選擇性的神經(jīng)元變性和缺失〔5〕。Aβ作為老年斑的主要組成成分，被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能障礙的主要原因〔6，7〕。近年來的實驗表明，促紅細(xì)胞生成素(EPO)作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子，在各種腦損害中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用〔8〕。但EPO能否對AD具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚未見報道。為探討EPO在AD治療中的潛力，本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態(tài)Aβ1～40的方法復(fù)制AD動物模型〔9～11〕，本實驗通過腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素(rHu-EPO)，觀察了EPO對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響和對海馬超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及實驗處理 雄性Wistar大鼠55只，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，動物批號:SCXK(豫)2005-2001，由河南省實驗動物中心提供。Y迷宮法篩選后，淘汰反應(yīng)過于靈敏和遲鈍7只大鼠后，48只大鼠隨機分為4組，正常對照組，生理鹽水組，模型組，EPO治療組，每組12只。動物自由飲食，晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度保持為15℃～20℃。

1.2 主要試劑和實驗儀器 Aβ1～40(美國Sigma公司)，rHu-EPO(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)，骨蠟(上海三友醫(yī)療器械有限公司)，多聚甲醛(BBI);Y-迷宮(MG-3型)(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)，腦立體定位儀(ZH-藍(lán)星B)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9080MBE)(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，透射電子顯微鏡(荷蘭FEI TecnaiG2)，電子天平(METTLER TOLEDO)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Aβ1～40孵育 將 1 mg Aβ1～40溶于 500 μl PBS，稀釋為2 μg/μl的濃度，置于37℃恒溫箱中連續(xù)孵育12 d，使蛋白充分伸展形成聚合態(tài)，然后4℃保存使用，忌反復(fù)凍融。

1.3.2 術(shù)前訓(xùn)練 48只大鼠每天上午固定時間Y迷宮訓(xùn)練，每天20次，連續(xù)5 d，每只大鼠都達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)即連續(xù)9次在60 s內(nèi)一次到達(dá)安全區(qū)。電刺激參數(shù):電壓50～70 V，延時5 s。

1.3.3 大鼠模型的建立 用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)，然后將其固定于腦立體定位儀上。參照Pellegrino和Cushman合著的《大鼠腦立體定位圖譜》〔2〕定位。定位方法為:以前囟為原點，向后4.0 mm，中線旁2.0～2.5 mm，顱骨面下進(jìn)針3.0～3.5 mm。用微量進(jìn)樣器施行注射，每只大鼠注射5μl。生理鹽水組按照AD模型組方法在海馬注射生理鹽水5 μl，正常對照組大鼠不做處理。EPO治療組大鼠在正常喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上從造模手術(shù)當(dāng)天開始腹腔注射5 000 IU/kg rHu-EPO，隔天1次，共5次。

1.3.4 Y迷宮行為學(xué)測試 手術(shù)后第10天各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。按照上述學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組中每只大鼠錯誤次數(shù)、嘗試次數(shù)和全天總反應(yīng)時間。

1.3.5 海馬電鏡標(biāo)本的制作及觀察 造模手術(shù)后第10天，Y迷宮測試完畢后，每組隨機抽取兩只用于透射電子顯微鏡取材。6%水合氯醛麻醉大鼠后用4%多聚甲醛400 ml灌注固定。切取海馬組織塊約1 mm3，經(jīng)漂洗液充分洗滌后，進(jìn)行梯度脫水。SPURR包埋劑包埋后，荷蘭FEI TECNAIG212透射式電鏡下觀察并照相。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 大鼠行為學(xué)測試后，常規(guī)灌注固定，石蠟包埋，冠狀位切片，厚6 μm。染色切片經(jīng)微波爐修復(fù)10 min。一抗(兔抗 NGF，1∶100)4℃過夜，ABC 法，DAB 顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)及記憶能力的改變 見表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s，n=12)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

0.39±0.48 10.10±0.28 60.54±5.19生理鹽水組 0.40±0.52 10.10±0.32 63.43±10.99模型組 1.75±1.281) 12.75±1.581) 96.43±23.011)EPO治療組 0.57±0.792) 10.14±0.382) 71.74±8.862)ER AR TRT正常對照組組別

2.2 EPO對大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組和生理鹽水組:電鏡下可見海馬神經(jīng)突觸前后膜均一，厚度適中，突觸前膜內(nèi)的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態(tài)正常，線粒體膜、脊完整，內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，表面游離核蛋白體較多。模型組:電鏡下神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)破壞，結(jié)構(gòu)紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊。EPO治療組:神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，突觸前膜內(nèi)突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴清晰可見，見圖1。

2.3 NGF免疫組化結(jié)果 正常對照組和生理鹽水組NGF表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)無明顯差異;與生理鹽水組比較，模型組NGF表達(dá)陽性的細(xì)胞明顯減少;與模型組比較，EPO治療組NGF表達(dá)陽性的細(xì)胞明顯增多，見圖2。

圖1 各組海馬的超微結(jié)構(gòu)

圖2 各組大鼠NGF免疫組化表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

EPO是刺激紅細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，是組織氧合狀態(tài)的一種主要決定因素，目前臨床上多用于貧血的治療。EPO在內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)中具有重要作用，在腎性貧血的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，EPO可以提高患者的認(rèn)知能力。本實驗結(jié)果提示EPO可以部分改善AD大鼠的認(rèn)知功能，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。線粒體是存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中、含有核外遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，是細(xì)胞的能力化工廠。大量的證據(jù)表明，AD的發(fā)生與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙密切相關(guān)〔12～14〕。突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間一種特化的細(xì)胞連接，是神經(jīng)元信號傳遞的重要結(jié)構(gòu)，通過它的傳遞作用實現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊。學(xué)習(xí)記憶與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān)。突觸結(jié)構(gòu)的破壞會中斷腦內(nèi)很多功能通路中的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴(yán)重的是認(rèn)知和記憶障礙〔15〕。研究表明〔16，17〕，突觸脫失是AD患者重要的組織形態(tài)學(xué)改變之一，其程度與癡呆嚴(yán)重程度相互聯(lián)，被認(rèn)為是癡呆患者認(rèn)知水平下降的基礎(chǔ)。在AD腦中，突觸數(shù)量減少以及突觸病理性變化較神經(jīng)元喪失更顯著，因此，突觸喪失是 AD 癡呆的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)〔16，18，19〕。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，EPO可以減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕AD大鼠的海馬超微結(jié)構(gòu)損傷程度，減輕其功能的喪失，進(jìn)而改善AD大鼠認(rèn)知功能障礙。

NGF是一類小分子多肽物質(zhì)，是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子超家族成員，其在促進(jìn)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化與成熟，維持神經(jīng)元的存活及促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)與再生方面有著極其重要的作用〔20～22〕。近來大量有關(guān)研究表明NGF缺乏與神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，特別是與AD的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔21，22〕，本實驗表明，EPO發(fā)揮保護(hù)AD樣大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞可能與增強海馬組織NGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，EPO可以改善大鼠由Aβ1～40引起的學(xué)習(xí)記憶障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力，這與減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕其功能的喪失，增加NGF蛋白表達(dá)促進(jìn)突觸發(fā)生有關(guān)，其深層機制仍有待進(jìn)一步探索。

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〔2013-09-27修回〕