瑞舒伐他汀對(duì)冠心病患者內(nèi)皮功能的影響

潘力健 劉 磊 尚文靜 龔 輝 (復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 201508)

血管內(nèi)皮作為機(jī)體最大的內(nèi)分泌腺，可通過(guò)多種機(jī)制在凝血和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中起重要作用。已有研究表明，內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的始動(dòng)因素之一，存在于冠心病的發(fā)生、發(fā)展中，甚至存在于冠心病發(fā)病之前〔1〕，因此，深入了解內(nèi)皮功能紊亂與冠心病之間的關(guān)系具有重要價(jià)值。瑞舒伐他汀可通過(guò)影響一氧化氮(NO)合酶(NOS)的活性，影響血管舒張因子內(nèi)皮源性NO釋放，來(lái)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能〔2〕。而非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA)及其特異性水解酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)是體內(nèi)維持NOS/NO水平平衡的重要因素，本文擬分析瑞舒伐他汀是否通過(guò)DDAH/ADMA通路影響NOS/NO水平，從而來(lái)改善血管內(nèi)皮功能，進(jìn)而起到治療冠心病的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 2013年6月至2014年6月我院在門(mén)診體檢的健康志愿者15例，冠心病患者30例。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合2006年AHA/ACC冠心病和其他動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病二級(jí)預(yù)防指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中冠脈造影冠狀動(dòng)脈狹窄大于50%;②無(wú)嚴(yán)重的心肝腎等臟器疾病;③患者無(wú)糖尿病，并且體質(zhì)指數(shù)(BMI)＜30 kg/m2，低密度脂蛋白(LDL)＜2.6 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn):①有活動(dòng)性肝病或肝功能異常、充血性心力衰竭、腎功能不全或出血傾向及過(guò)敏體質(zhì)者;②既往患有結(jié)核病，既往服用他汀類(lèi)藥物治療，存在多種疾病并長(zhǎng)期服用多種多類(lèi)(＞2種;＞2類(lèi))藥物者。本研究符合本單位倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.2 分組方法 冠心病患者隨機(jī)分為常規(guī)治療組和瑞舒伐他汀組，每組15例，常規(guī)治療組采取不包含瑞舒伐他汀的常規(guī)治療，瑞舒伐他汀組在常規(guī)治療組的基礎(chǔ)上運(yùn)用小劑量瑞舒伐他汀5 mg口服。4 w后抽取3組靜脈血進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 取各組上清，采用ELISA檢查各組血清ADMA、NOS和NO的表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 外周血循環(huán)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)分離及培養(yǎng) 取各組新鮮抗凝血液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)等倍稀釋?zhuān)瑢⑾♂屟壕徛佑?倍的淋巴細(xì)胞分層液上，水平離心，取細(xì)胞層重懸于PBS，洗滌離心后收集細(xì)胞于含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)液中，置37℃5%CO2孵箱賠養(yǎng)。72 h后棄掉懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，第7天時(shí)收集細(xì)胞備用〔3〕。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs免疫表型 收集第7天細(xì)胞，流式洗液洗滌，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml置于流式管中。加入熒光標(biāo)記的CD146抗體，混勻后4℃標(biāo)記30 min，洗去未結(jié)合的抗體后加入300 μl預(yù)冷的洗液重懸于流式管中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，相關(guān)軟件分析。

1.6 DDAH活性檢測(cè) 收集第7天細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解后取上清，應(yīng)用分光光度法檢測(cè) L-胍氨酸(L-cit)濃度來(lái)反映DDAH活性。設(shè)定健康對(duì)照組的DDAH活性為100%，其他組DDAH活性以與健康對(duì)照組的比值來(lái)表示。

1.7 DDAH mRNA測(cè)定 委托Takala公司進(jìn)行DDAH引物的設(shè)計(jì)，收集第7天細(xì)胞，采用Trizol一步法提取總RNA，cDNA的制備，將提出的總RNA進(jìn)行mRNA純化，在運(yùn)用純化的mR-NA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)DDAH mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ADMA、NOS和NO濃度變化 血清NO含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對(duì)照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05);血清NOS含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯低于健康對(duì)照組，瑞舒伐他汀組含量明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05);血清ADMA含量，常規(guī)治療組及瑞舒伐他汀組含量均明顯高于健康對(duì)照組，瑞舒伐他汀組含量明顯低于常規(guī)治療組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

表1 各組血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

與健康對(duì)照組相比:1)P＜0.05;與常規(guī)治療組相比:2)P＜0.05

組別 NO(μmol/L) NOS(μmol/L) ADMA(ng/ml)95.23±5.62 34.95±5.23 180.65±6.99常規(guī)治療組 69.21±6.011) 10.97±4.961) 260.78±6.261)瑞舒伐他汀組 76.91±5.491)2) 16.55±5.341)2)231.53±4.521)2)健康對(duì)照組

2.2 各組EPCs中CD146表達(dá)比例變化 常規(guī)治療組〔(60.59±4.63)%〕及瑞舒伐他汀組EPCs中CD146表達(dá)比例〔(68.22±5.11)%〕均明顯低于健康對(duì)照組〔(75.65±5.96)%〕，瑞舒伐他汀組比例明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

2.3 各組EPCs中DDAH活性變化 健康對(duì)照組的DDAH活性為100%，常規(guī)治療組(49.24%±5.65%)及瑞舒伐他汀組DDAH活性(62.13%±3.48%)均明顯低于健康對(duì)照組，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

2.4 各組EPCs中DDAH mRNA表達(dá)變化 常規(guī)治療組(0.60±2.34)及瑞舒伐他汀組 DDAH mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.71±3.82)均明顯低于健康對(duì)照組(1.00)，瑞舒伐他汀組活性明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)。

3 討論

血管內(nèi)皮是體內(nèi)重要屏障，通過(guò)多種機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程。研究證實(shí)，內(nèi)皮功能紊亂與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能與以下相關(guān):①內(nèi)皮功能紊亂可導(dǎo)致生成的NO含量減少，對(duì)LDL氧化修飾的抑制度降低，LDL生成增加，從而促進(jìn)了血管內(nèi)膜脂質(zhì)的沉積〔4〕;②NO可與體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)結(jié)合提高組織型纖溶酶原激活劑的活性，并且可抑制血小板聚集，影響血管內(nèi)炎性因子的分泌和調(diào)節(jié)，破壞血管內(nèi)皮影響血管功能〔5〕;③NO含量減少，導(dǎo)致內(nèi)皮素-1分泌增加，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和血管調(diào)節(jié)，導(dǎo)致了血管的損傷，從而促進(jìn)了冠心病的產(chǎn)生;④內(nèi)皮功能紊亂可導(dǎo)致氧自由基生成增多，使血管擴(kuò)張受抑制，使其抗血栓、抗黏附等能力降低，有利于冠心病的發(fā)生;⑤內(nèi)皮細(xì)胞受損，黏附因子表達(dá)增加，促進(jìn)了細(xì)胞間的黏附結(jié)合，使形成脂質(zhì)斑塊的能力增強(qiáng)〔6〕。NO在體內(nèi)是以L-精氨酸為底物，經(jīng)NOS催化而生成，體內(nèi)的ADMA為內(nèi)源性NOS抑制物，可抑制NO的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。DDAH是ADMA的特異性水解酶，位于內(nèi)皮樣細(xì)胞中，它在調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞內(nèi)ADMA水平中起關(guān)鍵作用，多數(shù)研究人員認(rèn)為，DDAH/ADMA通路與NO的生成、分泌、降解等密切相關(guān)〔7〕。

瑞舒伐他汀在臨床上的推廣多得益于調(diào)節(jié)血脂水平(尤其是LDL)來(lái)穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，從而改善糖尿病患者的臨床癥狀。不過(guò)近來(lái)發(fā)現(xiàn)，其具有獨(dú)立于調(diào)脂治療以外的多效性作用，如:抗炎作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞的作用，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，抑制血栓形成的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化或凋亡等作用，其中改善血管內(nèi)皮功能的作用倍受關(guān)注〔8〕。瑞舒伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮功能影響的可能機(jī)制有:①增加NO的釋放和利用度，降低LDL生成，從而減少了脂質(zhì)的沉積;②增加LDL氧化阻力;③抑制炎性反應(yīng);④促進(jìn)斑塊穩(wěn)定等〔9，10〕，但其具體機(jī)制仍未明確。

本研究提示了瑞舒伐他汀可能通過(guò)影響NO/NOS通路來(lái)發(fā)揮藥理作用。CD146是目前公認(rèn)的EPCs特異標(biāo)記分子，瑞舒伐他汀可通過(guò)調(diào)整EPCs來(lái)起到治療作用。瑞舒伐他汀可能通過(guò)影響DDAH/ADMA通路來(lái)影響內(nèi)皮功能，從而達(dá)到治療作用。然而，瑞舒伐他汀通過(guò)何種機(jī)制影響DDAH/ADMA通路，并且阻斷DDAH/ADMA通路是否可以阻斷瑞舒伐他汀的治療作用，還需要深入研究。

1 桑甜甜，劉 芳.內(nèi)皮祖細(xì)胞與沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)心血管雜志，2013;18(4):317-9.

2 陳 懿，徐世鄂.瑞舒伐他汀和阿托伐他汀對(duì)冠心病患者的調(diào)脂作用和安全性比較〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014;34(9):2389-90.

3 苗巧巧，陳 慧.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與腦血管性疾病〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2012;18(16):2542-4.

4 王 鋒.2型糖尿病合并冠心病患者血清C反應(yīng)蛋白和血清血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)及瑞舒伐他汀鈣的干預(yù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(4):913-4.

5 李 陽(yáng)，曾高峰.非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸、內(nèi)皮祖細(xì)胞與冠心病關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2013;13(6):674-5.

6 曹一顯，李良平.非酒精性脂肪性肝炎與內(nèi)皮功能異常和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系〔J〕.中華肝臟病雜志，2014;22(3):205-8.

7 王中群，楊永宗，嚴(yán)金川，等.免疫應(yīng)答與動(dòng)脈粥樣硬化〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013;15(11):1216-7.

8 韓健雄，王小扁，胡澤平，等.瑞舒伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化兔動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)的影響〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012;47(2):126-9.

9 馮雪茹，張婧薇，劉梅林，等.瑞舒伐他汀對(duì)中國(guó)頸動(dòng)脈粥樣硬化患者內(nèi)中膜厚度和安全性的薈萃分析〔J〕.中華心血管病雜志，2014;42(3):247-53.

10 杜瑞雪，葉 平，顏光濤，等.瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療對(duì)外周動(dòng)脈粥樣硬化患者粘附分子的影響及上游機(jī)制〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012;32(11):1610-4.