TOLL樣受體在新生兒感染性疾病中的表達分析

徐頌周 彭 華 胡曉艷 趙 方 周于新

TOLL樣受體在新生兒感染性疾病中的表達分析

徐頌周 彭 華 胡曉艷 趙 方 周于新

目的 觀察Toll樣受體1、2、3、4在新生兒感染性疾病中的表達情況，探討它們在新生兒抗感染免疫中的作用。方法 收集感染性疾病患兒外周血（感染性疾病包含有敗血癥、細菌性肺炎、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、尿路感染）和愛嬰?yún)^(qū)健康新生兒對照組外周血。采用RT-PCR法測定TLR1～4mRNA轉(zhuǎn)錄水平（與hGAPDH拷貝數(shù)比較）。結(jié)果 （1）TLR1、2、4 mRNA在感染組表達明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;（2）TLR3 mRNA在感染組表達較正常對照卻明顯下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 與TLR 2、TLR 4一樣，TLR1和TLR3也參與了新生兒感染性疾病的調(diào)控，但具體信號傳導途徑尚需進一步研究。

TOLL樣受體；新生兒；感染

新生兒由于免疫功能尚未發(fā)育完善，受多種易感因素影響，易發(fā)生感染性疾病，此類疾病病死率高，已成為圍生期及新生兒期死亡的重要原因之一。但由于新生兒期感染癥狀不典型，病情進展快，且缺乏特異有效的檢測手段，嚴重制約了臨床診療工作。哺乳類動物的抗感染免疫主要有天然免疫及后天獲得性免疫。天然免疫是機體抵御病原微生物感染的第一道防線。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為天然免疫系統(tǒng)最重要的模式識別受體之一，在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用[1]，能極早期識別病原產(chǎn)生的分子及組織損傷產(chǎn)生的某種物質(zhì)，并激活免疫系統(tǒng)進一步反應，因此TLRs在機體防御反應中的重要性受到越來越多的關(guān)注，成為近年來的一個研究熱點。現(xiàn)已有較多關(guān)于Toll樣受體2、4(TLR2、4)與感染、腫瘤、風濕免疫等免疫性疾病相關(guān)報道，但它們尤其TLR1及TLR3是否亦與新生兒感染性疾病有關(guān)，承擔什么角色等目前尚較少該方面的研究。為此，本研究檢測在新生兒感染性疾病中TLR1～4的表達情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 感染組：選取2009年6月～2010年6月北京大學深圳醫(yī)院新生兒科感染性疾病患兒50例（新生兒敗血癥10例，腦膜炎3例，肺炎20例，壞死性小腸炎12例，尿路感染5例），采外周血2mL肝素抗凝超低溫冷凍備用。對照組：隨機采集愛嬰?yún)^(qū)健康新生兒外周血標本48份。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗儀器與試劑 梯度PCR儀（Eppendorf公司，法國），UVP凝膠圖像掃描儀，Labwork 3.0分析軟件（UVP公司，美國），E.N.Z.A.Blood RNA Mini kit購自Promega公司。Random primer、dNTP、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、電泳級瓊脂糖(Promega公司，美國)，Ex-Taq?DNA polymerase、DNA Marker 500bp(Takara公司，日本)。EmaldAmp PCR Master Mix購自TaKaRa公司。基因引物合成在上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 標本收集與處理 感染組在使用抗生素前，于確診后用肝素抗凝管抽取外周靜脈血2mL凍存-80℃低溫冰箱，用E.N.Z.A.Blood RNA Mini kit提取總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。對照健康組新生兒采外周靜脈血，標本處理同上。

1.2.3 RT-PCR法檢測TLR1-4mRNA表達情況。見表1。

表1 各基因引物設計情況

經(jīng)不同循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物的圖像分析，證實上述循環(huán)參數(shù)基本使PCR擴增在指數(shù)期內(nèi)。模板量及循環(huán)數(shù)經(jīng)檢測均在線性范圍內(nèi)。各檢測基因的退火溫度及循環(huán)數(shù)。見表2。

表2 各檢測基因的退火溫度及循環(huán)數(shù)

1.2.4 電泳及半定量分析 配制1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，取各檢測基因PCR產(chǎn)物各5μL，加1μL上樣緩沖液進行電泳，電壓為100v，恒壓電泳2小時后紫外燈下觀察結(jié)果。以GAPDH基因為內(nèi)參，應用UVP凝膠成像系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物電泳條帶進行密度掃描，用Labword3.0軟件測定電泳條帶密度值，各檢測基因的表達水平以該標本GAPDH基因條帶密度為參照。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料用“x±s”表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，方差不齊時應用NOSA5.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

感染性新生兒與對照組各基因表達差異情況 由圖1各基因的RT-PCR檢測結(jié)果可見，TLR1、TLR2、TLR4基因在感染組表達水平顯著高于對照組，而TLR3基因在感染組表達下調(diào)。2組基因在表達水平上差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖1 RT-PCR驗證基因圖

表3 受驗證基因在感染組與對照組的表達水平比較

3 討論

TLR是與果蠅Toll蛋白具有同源性的表達于細胞膜上與免疫系統(tǒng)識別微生物有關(guān)的一類受體家族，能夠識別特定類型微生物的保守的分子成分[2]。TLR是參與非特異性免疫的一類重要分子，能結(jié)合機體自身產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子(即內(nèi)源性配體)，從而對天然免疫功能產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。TLR家族目前有十余種TLRs，TLR2和TLR4主要在細胞膜表面表達，其他TLRs均在細胞內(nèi)表達。目前對TLR2和TLR4的作用研究較多，主要集中在新生兒感染、窒息缺氧等應激狀態(tài)中的表達情況，Kenzel等[3]認為開展TLR系列受體研究尤其是TLR2，有望使新生兒敗血癥免疫研究產(chǎn)生革命性變化。本文研究結(jié)果亦顯示在感染性疾病中TLR2及TLR4表達明顯升高。TLR3是病毒雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)識別受體。由于dsRNA是病毒復制過程中普遍存在的中間產(chǎn)物，因此TLR3在宿主抗病毒天然免疫反應中發(fā)揮重要作用。Hajjar AM等［4］研究發(fā)現(xiàn)TLR3可以被部分有鞭毛的細菌所激活從而活化先天性免疫系統(tǒng)，但近年研究發(fā)現(xiàn)TLR3主要參與抗乙肝病毒、抗腫瘤等免疫反應過程中［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染性新生兒血液中其表達未出現(xiàn)上調(diào)情況，考慮本研究選取病例主要為細菌性感染為主，其激活的信號途徑不同，但表達反而下調(diào)機制不明，尚需進一步研究。TLR1主要在單核細胞、中性粒細胞、B細胞、自然殺傷細胞上表達，目前在感染方面的研究比較少，Medvedev[6]等研究TLR介導的炎癥機制發(fā)現(xiàn)，TLR1可與TLR2形成二聚體共同作用于TLR2介導的炎癥因子釋放通路［7］，最新的研究結(jié)果顯示TLR1介導了幽門螺旋桿菌感染的炎癥反應過程［8］。本研究發(fā)現(xiàn)在新生兒感染性疾病中TLR1的表達顯著上調(diào)，考慮是否與TLR2共同作用于一個炎癥因子釋放通道。因TLR家族的成員眾多，故為充分反映新生兒感染性疾病的免疫學機制，還需進一步研究TLR家族的其他成員，及其成員之間相互表達關(guān)系。

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Objective To observe the expression of Toll sample receptors 1, 2, 3, 4 in neonatal infectious diseases and to explore their roles in neonatal anti-infectious immunity.Methods The Peripheral Blood (PB) of the infant patients with infectious diseases (infectious diseases include sepsis, bacterial pneumonia, meningitis, necrotizing enterocolitis and urinary tract infection) and the PB of the control group of healthy newborns at the baby loving area had been collected. RT-PCR method had been used to determine the transcriptional level of TLR1-4mRNA (compared to hGAPDH copy number).Results (1) The expression of TLR1, 2, 4 mRNA was significantly increased in the infected group, and was significantly different from that in the control group (P＜0.05); (2) The expression of TLR3 mRNA in the infected group was relatively normal, which however was significantly lowered in the control group. There was statistically significant difference between the two groups (P＜0.05).Conclusion Just like TLR 2 and TLR 4, TLR1 and TLR3 also participate in the regulation and control of neonatal infectious diseases, but the specific signal transduction pathways still need further study.

Toll-like receptors; Neonates; Infection

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.19.001

2009年深圳市科技計劃項目（200903083）

廣東 518036 北京大學深圳醫(yī)院兒科 （徐頌周 彭華 胡曉艷趙方 周于新）