HPLC法同時測定5種抗癲癇藥的血清藥物濃度

周 晶王漪檬趙寧民段虹飛馬愛玲趙紅衛(wèi)郭玉忠

1.鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南鄭州 450001；2.鄭州大學人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院藥學部，河南鄭州 450003

HPLC法同時測定5種抗癲癇藥的血清藥物濃度

周 晶1,2王漪檬2趙寧民2段虹飛2馬愛玲2趙紅衛(wèi)2郭玉忠1▲

1.鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南鄭州 450001；2.鄭州大學人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院藥學部，河南鄭州 450003

目的建立同時測定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮血清濃度的HPLC法。方法血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后直接進樣分析，色譜柱為Waters C18（5μm，4.6×250mm）柱，流動相為甲醇-水（55∶45），檢測波長235nm。結果在一定濃度范圍內(拉莫三嗪：1.3～50.0μg/mL；苯巴比妥：2.5～100.0μg/mL；苯妥英：2.2～70.0μg/mL；卡馬西平：1.8～35.0μg/mL；氯硝西泮：2.5～80.0μg/mL），各藥物的峰面積與濃度呈良好的線性關系。低、中、高濃度的質控樣品回收率均高于95%，相對標準差（RSD）均小于10%。結論本方法操作簡便，結果穩(wěn)定可靠，適用于臨床進行血藥濃度監(jiān)測。

抗癲癇藥；血藥濃度；高效液相色譜法；治療藥物監(jiān)測

藥物反應會因人而異，給予相同劑量的藥物，在患者身上可能會出現(xiàn)不同的藥理作用，開展治療藥物監(jiān)測可以提高藥物臨床療效、減少毒副反應[1]。拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮均屬安全范圍較窄的藥物，在臨床應用中需開展血藥濃度監(jiān)測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（戴安P680），電子分析天平（島津AUW 120D）；液體快速混合器（YKH-II，江西醫(yī)療器械廠）；高速冷凍離心機（HC-3618R，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；多管架自動平衡離心機（TDZ5-WS型，湘儀離心機廠），可調移液器（eppendorf）等。

1.2 試藥

拉莫三嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100775-200401）；苯巴比妥對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：1222-9602）；苯妥英對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100210-201002） ；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100142-201105）；氯硝西泮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171227-200302）；甲醇為色譜純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Waters C18（5μm，4.6×250mm）；流動相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：235nm；進樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 準確稱取拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮對照品適量，分別甲醇溶解并定容至10mL，配成濃度分別為500、1000、700、350、800μg/mL，的對照品儲備液。

2.2.2 標準血樣的制備 分別精密移取各藥物對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成為標準系列溶液。將上述標準系列溶液加入適量空白血清，配制成含拉莫三嗪1.3、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0μg/mL；含苯巴比妥2.5、5.0、20.0、25.0、50.0、100.0μg/mL；含苯妥英2.2、4.4、8.8、17.5、35.0、70.0μg/mL；含卡馬西平1.8、4.4、7.0、8.8、17.5、35.0μg/mL；含氯硝西泮2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL的系列濃度混合標準血清溶液，置-40℃冰箱保存。

2.2.3 質控血清的制備 分別精密移取各藥物對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成為標準系列溶液。將上述標準系列溶液加入適量空白血清，配制成；含拉莫三嗪1.3、12.5、50.0μg/mL；含苯巴比妥2.5、25.0、100.0μg/mL；含苯妥英2.2、17.5、70.0μg/mL；含卡馬西平1.8、8.8、35.0μg/mL；含氯硝西泮2.5、20.0、80.0μg/mL的低、中、高質控血清溶液，置-40℃冰箱保存。

2.3 樣品處理方法

取200μL血清樣品，加入600μL甲醇，渦旋混勻，15000r/min離心5min。取上清液20μL進樣。

2.4 專屬性試驗

取空白血清按“2.3”項下方法處理后分析，考察內源性物質干擾；根據(jù)臨床常用抗癲癇藥情況，在相同色譜條件下考察丙戊酸、奧卡西平、托吡酯對實驗的干擾。在本試驗色譜條件下，內源性物質和上述3種藥物不干擾測定，各藥物分離良好（分離度R≥1.5）。5種藥物的保留時間依次為拉莫三嗪3.821min、苯巴比妥4.465min、苯妥英8.520min、卡馬西平10.248min、氯硝西泮11.384min。高效液相色譜圖見圖1。

2.5 線性關系考察

取系列混合標準血清溶液各200μL，按“2.3”項下樣品處理法操作后進樣。以對照品峰面積（y）對濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程與線性關系見表1。結果表明，各藥物的峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.6 精密度與準確性

取低、中、高三個濃度質控血清，按“2.3”項下方法處理，取上清20μL進樣分析，每個樣本連續(xù)進樣3次，計算相對標準差（RSD），評估精密度，結果見表2。

圖1 高效液相色譜圖：A空白血清色譜圖；B 樣品色譜圖（1拉莫三嗪、2苯巴比妥、3苯妥英、4卡馬西平、5氯硝西泮）

表1 回歸方程與線性范圍

取低、中、高三個濃度質控血清，按“2.3”項下方法處理，每個濃度平行制備3份，取上清20μL直接進樣分析。代入“2.5”項下回歸方程計算，以所得檢測數(shù)值除以質控血清理論數(shù)值，得相對回收率，以相對回收率結果考察準確性，結果見表2。

2.7 室溫穩(wěn)定性試驗

取中濃度質控血清，按“2.3”項下方法處理，分別在室溫（25℃）放置4、8、12h后取上清20μL進樣分析。各藥物相對標準差（RSD）均在5%以內表明血漿樣品在室溫放置12h穩(wěn)定性良好，臨床中收取的血樣在12h內檢測可滿足要求。見表3。

3 討論

拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮均屬安全范圍較窄的藥物，在臨床應用中需開展血藥濃度監(jiān)測[2-6]。過去受檢測設備限制，檢測上述多種藥物需在不同色譜條件下分別進行檢測，耗時耗力。如果能將上述藥物在一個色譜條件下同時檢測，將大大節(jié)省人力物力，具備更好的臨床應用價值。隨著檢測技術的進步，當前已經(jīng)能建立同時測定多種藥物的方法學[7-9]。本研究建立了同時測定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮血清濃度的HPLC法，方法操作簡便，結果穩(wěn)定可靠，適用于臨床進行血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學研究。

表2 精密度與準確性試驗

表3 室溫穩(wěn)定性試驗

高效液相檢測波長的選擇：本研究分別考察了210、235、254、285nm等波長，經(jīng)過對比，最終選擇235nm作為檢測波長。在該波長下內源性物質干擾小，適合這幾種藥物的檢出和分離。流動相選擇時，未選擇乙腈，選擇甲醇-水作為流動相，該流動相價廉且分離效果能滿足檢測要求。生物樣品處理時，采用了甲醇沉淀蛋白法，操作快捷，處理得到的樣品干擾較少，能滿足檢測需要。

精密度是指多次重復測定同一樣本時各測定值之間彼此相符合的程度，用于評估樣本檢測過程中隨機誤差的大小。本研究中，拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮的低、中、高三個濃度質控血清連續(xù)進樣3次，相對標準差（RSD）均小于10，表明本方法精密度較好。

準確度指在一定實驗條件下多次測定的平均值與真值相符合的程度，在臨床檢測中常用回收率來表示。本研究中，拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平和氯硝西泮的低、中、高三個濃度質控血清的相對回收率均高于95%，表明本方法學準確度較佳。

采用HPLC法可同時監(jiān)測多種藥物的血藥濃度，方法準確可靠，實用性強，適用性廣[10-11]。本研究建立的方法操作簡便，結果穩(wěn)定可靠，可用于各級醫(yī)療機構開展治療藥物監(jiān)測和藥代動力學研究。

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Simultaneous determination of concentration of 5 kinds of antiepileptic in human serum by HPLC

ZHOU Jing1,2WANG Yimeng2ZHAO Ningmin2DUAN Hongfei2MA Ailing2ZHAO Hongwei2GUO Yuzhong1

1.Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China; 2.Department of Pharmacy, People's Hospital of Zhengzhou University,He'nan Province People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

ObjectiveTo develop a new method for simultaneously determining Lamotrigine, phenobarbital, phenytoin, carbamazepine and clonazepam in human serum by HPLC.MethodsSerum samples were analyzed after protein deposition by methanol.The HPLC method was performed on the column of Waters C18(5μm, 4.6×250mm) with mobile phase consisted of ethanol-water (55∶45), the UV detection wavelength was 235nm.ResultsIn a certain range of concentration (lamotrigine: 1.3-50.0μg/mL; phenobarbital: 2.5-100.0μg/mL; phenyltoin: 2.2-70.0μg/mL; carbamazepine: 1.8-35.0μg/mL; clonazepam: 2.5-80.0μg/mL), there was a good linear relationship between peak area and concentration of each drug. Low、medium and high concentration of the quality control sample recovery rate was higher than 95%, the relative standard deviation (RSD) is less than 10%.ConclusionThe method provides a sensitive, accurate, precise and reliable analytical procedure for clinical monitoring of 5 compounds which is suitable for therapeutic drug monitoring.

Antiepileptic; Plasma concentration; HPLC; TDM

R742.1

B

2095-0616（2015）05-39-03

2014-12-08）

河南省科技攻關計劃項目（142102310416）。

▲通訊作者