益精方對腺嘌呤法大鼠睪丸組織中TGF-β3 mRNA及蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

呂世軍 陳 東 叢 萃 王家輝**.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（沈陽 0847）；. 海南醫(yī)學(xué)院

益精方對腺嘌呤法大鼠睪丸組織中TGF-β3 mRNA及蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

呂世軍1陳 東2叢 萃2王家輝2**
1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)（沈陽 110847）；2. 海南醫(yī)學(xué)院

目的 觀察益精方對腺嘌呤法不育癥大鼠睪丸組織中TGF-β3 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。 方法選用48只健康的SPF級Wistar雄性大鼠，2月齡，體質(zhì)量（180±20）g，隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)方玄駒組和益精方組，每組12只。除空白組外，其余各組均以腺嘌呤1 mL/（100g?d）的劑量連續(xù)灌胃12d；從第13天開始，空白組及模型組用等量生理鹽水灌胃，復(fù)方玄駒組以復(fù)方玄駒膠囊水溶液灌胃，益精方組以益精方湯劑灌胃，每天一次，連續(xù)20d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，摘取睪丸，采用免疫組化技術(shù)測定大鼠睪丸組織中TGF-β3的表達(dá)；采用RTPCR技術(shù)測定TGF-β3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組中TGF-β3及TGF-β3 mRNA的表達(dá)均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，復(fù)方玄駒組和益精方組中TGF-β3及TGF-β3 mRNA的表達(dá)均有所下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 益精方對腺嘌呤法誘導(dǎo)的大鼠睪丸組織中TGF-β3及TGF-β3mRNA的高表達(dá)具有明顯的抑制作用。

益精方； 腺嘌呤； 轉(zhuǎn)化生長因子β3； 不育， 男性

目前，我國約有1250萬對不孕不育夫婦，男性因素所致者約占40% ，這其中70%以上病因不明，即使在已知病因的男性不育中，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此男性不育的診治有其復(fù)雜性和特殊性。中醫(yī)學(xué)以辨證論治為主，多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用于機(jī)體，在男性不育的治療中取得了較好的療效［1］。益精方是賈金銘教授根據(jù)自己幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)，在千年名方五子衍宗丸的基礎(chǔ)上化裁所得的，臨床應(yīng)用近20年，對男性不育癥有非常好的療效。經(jīng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β3可以控制血-睪屏障的開啟與閉合，控制精子生成過程中生精細(xì)胞向管腔的運(yùn)動，從而影響精子的產(chǎn)生，導(dǎo)致男性不育癥［2］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察益精方對腺嘌呤法不育癥大鼠睪丸組織中TGF-β3表達(dá)的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

選用48只健康的、具有生殖能力的SPF級Wistar雄性大鼠，2月齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK2010-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲食。

二、實(shí)驗(yàn)藥品

復(fù)方玄駒膠囊，0.42g×54粒，施強(qiáng)藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20060462。益精方：桑椹20g、桑螵蛸20g、菟絲子20g、肉蓯蓉12g、仙靈脾12g、黃精15g、五味子15g、當(dāng)歸10g、紅花6g、黃芪15g、蒼術(shù)12g，共11味中藥組成。所有飲片的采購、藥物制備及質(zhì)控均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室完成。

三、主要試劑及儀器

腺嘌呤，購自北京市化學(xué)試劑公司；兔抗大鼠TGF-β3抗體，購自北京博奧森生物科技有限公司；免疫組化通用Sp試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司；Trizol，購自invitrogen公司；兩步法RT-PCR試劑盒和DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。脫水機(jī)（LEICA300型）、石蠟包埋機(jī)（EG1150型）、切片機(jī)（LEICA RM2235）型均為德國徠卡公司生產(chǎn)。數(shù)碼顯微鏡（OLYMPUS BX41型）、生物顯微鏡（CHA型）均為日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。電泳儀，北京六一儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alphainnotech chemi Imager。水平搖床，北京六一儀器廠。

四、分組、模型的建立及干預(yù)方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將48只Wistar雄性大鼠平均分為4組：空白組，模型組，復(fù)方玄駒組和益精方組，每組12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后進(jìn)行模型建造。按王家輝等［3］腺嘌呤改進(jìn)法，除空白組外，其余各組將腺嘌呤按500 mg/mL濃度配置，并加入與腺嘌呤1:10比例的阿拉伯膠助溶，以1mL/100g?d劑量連續(xù)灌胃12d；從第13天開始，空白組及模型組用等量生理鹽水灌胃，復(fù)方玄駒組以復(fù)方玄駒膠囊水溶液2mL灌胃，益精方組以益精方湯劑3mL灌胃，qd，連續(xù)20d。

五、檢測指標(biāo)及方法

（一）免疫組織化學(xué)法檢測睪丸組織中TGF-β3表達(dá)水平

各組大鼠干預(yù)后頸椎脫位處死，解剖摘取睪丸，4%多聚甲醛固定液固定，將固定好的睪丸組織取出，自來水下充分沖洗，沖洗后經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水，石蠟包埋、切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟，采用SP法對組織中TGF-β3表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

（二）RT-PCR法檢測睪丸組織中TGF-β3 mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法抽提睪丸組織中總RNA，依吸光度值，取等量總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用Tag酶，按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。TGF-β3上游引物為：5’-TGCGCCCCCTCTACATTG-3’，下游引物為：5’-GGTTCGTGGACCCATTT- CC-3’，產(chǎn)物長85bp。同時(shí)以β-actin為內(nèi)參照，引物序列為：上游：5'- CCAACCGTGAGAAGATGACA -3'；下游：5'- TCGCCAGAATCCAGAACAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長130bp。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性120s，再經(jīng)94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s共30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸120s。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存。于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像并測定目的基因及內(nèi)參基因條帶的積分光密度值，以（目的基因積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值）比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組大鼠睪丸組織中TGF-β3蛋白的表達(dá)

各組大鼠睪丸組織中TGF-β3、TGF-β3mRNA表達(dá)比較，從表1顯示：模型組大鼠睪丸組織中TGF-β3表達(dá)水平較空白組明顯提高（P＜0.01），而復(fù)方玄駒膠囊組及益精方組有明顯下調(diào)作用（P＜0.05）。

表1 各組大鼠睪丸組織中TGF-β3表達(dá) （）

表1 各組大鼠睪丸組織中TGF-β3表達(dá) （）

注: 與模型組比較， *P＜0.05， **P＜0.01

組別 n TGF-β3空白組 10 0.13±0.01**模型組 10 0.27±0.01復(fù)方玄駒組 10 0.22±0.01*益精方組 10 0.20±0.02*

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TGF-β3蛋白在睪丸組織的表達(dá)主要分布于胞漿，在組織切片中表現(xiàn)為胞漿染色呈黃色或棕褐色的陽性標(biāo)志。凡染色強(qiáng)度明顯高于背景顏色的為陽性表達(dá)。空白對照組大鼠睪丸組織中TGF-β3蛋白表達(dá)基本呈陰性，偶見弱陽性表達(dá)細(xì)胞，胞漿呈現(xiàn)淡黃色（見圖1A）。模型對照組大鼠睪丸組織中TGF-β3蛋白表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞主要分布于各級生精細(xì)胞。鏡下可見大量強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞（見圖1B）。復(fù)方玄駒膠囊組大鼠睪丸組織中TGF-β3蛋白表達(dá)呈現(xiàn)陽性，陽性細(xì)胞主要分布于次級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞，陽性細(xì)胞漿內(nèi)可見黃色或褐色陽性產(chǎn)物。陽性細(xì)胞數(shù)略多于益精方組，但明顯少于模型對照組（見圖1C）。益精方組大鼠睪丸組織中TGF-β3蛋白表達(dá)呈現(xiàn)陽性，陽性細(xì)胞主要分布于次級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞，陽性細(xì)胞漿內(nèi)可見黃色或褐色陽性產(chǎn)物。陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型對照組（見圖1D）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測睪丸組織TGF-β3表達(dá)A: 空白組大鼠睪丸生精上皮中TGF-β3的表達(dá)（DAB， ×400）； B: 模型組大鼠睪丸生精上皮中TGF-β3的表達(dá)（DAB，×400）； C: 復(fù)方玄駒膠囊組大鼠睪丸生精上皮中TGF-β3的表達(dá)（HE，×400）； D: 益精方組大鼠睪丸生精上皮中TGF-β3的表達(dá)（HE，×400）

二、RT-PCR法檢測睪丸組織中TGF-β3 mRNA表達(dá)水平結(jié)果

由TGF-β3與內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，擴(kuò)增產(chǎn)物為分子量大小約為85、130bp的兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖2）。

圖2 TGF-β3 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物紫外凝膠成像

結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組TGF-β3mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方玄駒膠囊組及益精方組均表現(xiàn)為明顯的下調(diào)作用（P＜0.05），（見表2）。

表2 各組大鼠睪丸組織中TGF-β3mRNA表達(dá)（）

表2 各組大鼠睪丸組織中TGF-β3mRNA表達(dá)（）

注: 與模型組比較， *P＜0.05， **P＜0.01

組別 n TGF-β3mRNA空白組 10 0.29±0.03**模型組 10 0.69±0.04復(fù)方玄駒組 10 0.54±0.04益精方組 10 0.51±0.04*

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化技術(shù)和RT-PCR及紫外凝膠成像技術(shù)檢測了腺嘌呤法不育癥大鼠睪丸組織中TGF-β3在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)情況。國內(nèi)外有關(guān)研究睪丸性不育動物的模型實(shí)驗(yàn)有多種，但有實(shí)驗(yàn)表明，腺嘌呤有通過影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞中TGF-β3的表達(dá)來抑制生精過程的作用［4，5］，因此本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤模型。根據(jù)王家輝等［3，6，7］的研究，確定以1mL/100 g?d劑量腺嘌呤連續(xù)灌胃12d ，這是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳模型。模型動物從腺嘌呤灌胃開始逐漸出現(xiàn)發(fā)育遲緩，體質(zhì)量減輕，體毛稀疏脫落且無光澤、反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)取暖、少動萎靡等腎陽虛現(xiàn)象并伴有精子濃度、活力、T、LH 水平等客觀指標(biāo)的明顯下降，臨床常用促生育的“益精方”有明顯的調(diào)整作用。

精子發(fā)生需要在生精上皮的特殊微環(huán)境中進(jìn)行，其中最為熟悉的是血-睪屏障（the blood-testis barrier， BTB），它主要由睪丸支持細(xì)胞之間的緊密連接所構(gòu)成。一旦睪丸支持細(xì)胞的緊密連接受到損害就會阻礙睪丸的生精過程［8］。目前，在睪丸支持細(xì)胞緊密連接內(nèi)己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三類結(jié)構(gòu)膜蛋白：claudins、閉鎖蛋白（occludins）和連接黏附分子JAMs，并鑒定了一些其他的周圍膜蛋白，如閉合小環(huán)蛋白-1 （zonula occludens-l， Z0-1）和 ZO-2等［9］。研究證實(shí)，TGF-β3可以與存在于支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞中的受體結(jié)合，通過p38-MAPK信號途徑下調(diào)BTB上的蛋白o(hù)ccludin，claudin-11、JAM-A和ZO-1的水平來干擾支持細(xì)胞緊密連接屏障，從而通過這些蛋白的表達(dá)來調(diào)控BTB的動態(tài)開放［10-12］。BTB的有序開放有賴于occludins， claudins和連接黏附分子（JAMS）這三類結(jié)構(gòu)膜蛋白的調(diào)節(jié)，從而保證精子的生成［13］。研究發(fā)現(xiàn)，離體情況下，BTB的形成伴隨的是TGF-β2和TGF-β3表達(dá)明顯下降。在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過睪丸內(nèi)注射TGF-β3，BTB可被分解，并且這種分解是可逆的［14］。本實(shí)驗(yàn)也證明了益精方對腺嘌呤法誘導(dǎo)的大鼠睪丸組織中TGF-β3及TGF-β3mRNA的高表達(dá)具有明顯的抑制作用，從而改善了模型大鼠睪丸支持細(xì)胞的緊密連接狀態(tài)，從這個(gè)方向闡述了益精方治療男性不育的機(jī)制。

益精方是中國中醫(yī)科學(xué)院賈金銘教授根據(jù)中醫(yī)的理論，結(jié)合現(xiàn)代中藥學(xué)的藥理研究，經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來的治療男性不育癥的方劑。全方由當(dāng)歸、紅花、淫羊藿、菟絲子、桑螵蛸等11味中藥組成。李柱等［15］研究表明大劑量益精方干預(yù)可降低環(huán)磷酰胺小鼠精子的凋亡率，增加小鼠精子密度、活力，并增加精子線粒體功能，從而達(dá)到治療少弱精子癥的目的。王力等［16］研究結(jié)果表明，益精方通過促進(jìn)Bcl-2蛋白、抑制Bax蛋白的表達(dá)，抑制生精細(xì)胞的凋亡。王家輝等［17］研究顯示益精方能夠改善腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛不育癥大鼠的性激素水平，修復(fù)受損的生精上皮，同時(shí)提高精子的活力和濃度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益精方對腺嘌呤法不育癥大鼠睪丸組織中TGF-β3及TGF-β3mRNA的表達(dá)升高具有明顯的抑制作用，進(jìn)而使模型大鼠睪丸支持細(xì)胞的緊密連接狀態(tài)得到一定程度的恢復(fù)，其療效與行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的治療男性不育癥療效突出的復(fù)方玄駒膠囊無顯著性差異。今后將就益精方對腺嘌呤法腎陽虛不育癥大鼠支持細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行研究，進(jìn)而闡明該動物模型睪丸生精障礙的機(jī)制及益精方的藥理作用。

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（2015-03-01收稿）

Effects of Yijing Fang on the expression of TGF- beta 3 in testicular tissues of adenine-induced infertility rats*

Lv Shijun1， Chen Dong2， Cong Cui2，Wang Jiahui2**
1. Liaoning University of Traditional Chines Medicine， Shenyang 110847， China； 2. Hainan Medical University

Wang Jiahui， E-mail: 1002459426@qq.com ； Tel: 0898-66982198

Objective To observe the in uence of YiJing Fang on the expression of TGF-beta 3 in the testis tissues of adenine -induced infertility rats. Methods Total of 48 SPF- grade healthy male Wistar rats with March age， weight （180±20）g，were randomly divided into four groups such as the blank group， the model group， compound Xuanju group， Yijing Fang group， 12 rats in each group. Except rats in the blank group， rats in the other groups were intragastrically administratedwith a dose of 1 mL/ （100g d）adenine for 12 days； On the 13th day， rats in the blank group and the model group were intragastrically treated with normal saline， and the rats in compound Xuanju group with compound Xuanju capsule aqueous gavage， and the rats in Yijing Fang Group with Yijing Fang Decoction， once a day for 20 consecutive days. After the end of the experiment the rats were sacri ced and their testis and epididymis were collected for TGF- beta 3 expression analysis. Results Compared with that of the blank group， the expression of TGF- beta 3 model group was remarkably increased， the difference was statistically signi cant （P＜0.01）. Compared with that of the model group， the expressions of TGF- beta 3 in compound Xuanju group and Yi Jing Fang Group were all decreased， the difference was statistically signi cant （P＜0.05）. Conclusion Yijing Fang may obviously inhibit high expression of TGF- beta 3 in testis of adenine-induced infertility rat.

Yijing Fang； adenine； Transforming Growth Factor beta3； infertility， male

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.002

資助: 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81260591）

**通訊作者， E-mail: 1002459426@qq.com ； Tel: 0898-66982198