高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定消字號(hào)乳膏中8種抗真菌藥物

趙麗紅 路亞靜 李忠華

（太原市食品藥品檢驗(yàn)所 山西太原 030001）

1 前言

抗真菌藥物為抑制或者殺滅致病真菌的藥物，按其作用特點(diǎn)分為抗淺部真菌藥、抗深部真菌藥、對(duì)深部和淺部真菌感染均有效藥物等[1]。治療真菌感染療程較長(zhǎng)，療程不足則易復(fù)發(fā)[2]；濫用或長(zhǎng)期使用抗真菌藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，危害患者身體健康[3-5]。

消字號(hào)乳膏為消毒類產(chǎn)品，消毒產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范（2009年版）[6]第30條明確列出“消毒產(chǎn)品禁止使用抗生素、抗真菌藥物、激素等物料”。部分不法商家利益至上，為提高產(chǎn)品療效、增加銷量，在此類產(chǎn)品中添加抗真菌藥物，從而造成消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)損失及健康損害。2019年，國(guó)外期刊柳葉刀發(fā)表了“消字號(hào)”產(chǎn)品中檢出抗真菌藥物的文章[7]，國(guó)內(nèi)新聞媒體中也常有相關(guān)報(bào)道。本文建立了HPLC-MS/MS法測(cè)定“消字號(hào)”乳膏基質(zhì)中8種常見抗真菌藥物的檢驗(yàn)方法，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及實(shí)體店購(gòu)買的“消字號(hào)”乳膏進(jìn)行了測(cè)定，為市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)參考作用。

2 材料與方法

2.1 儀器

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（島津公司，LCMS 8050）；色譜柱：shim-pack XR-ODS 2.0×100 mm，2.2μm；MS105DU電子天平（瑞典梅特勒-托利多公司）；XPE304電子天平（瑞典梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 試劑

甲酸（LC-MS級(jí)，日本TCI公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merk公司）；灰黃霉素、克霉唑、聯(lián)苯芐唑、萘替芬、酮康唑、益康唑等6種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于BePure公司；硝酸咪康唑、鹽酸特比萘芬2種標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。實(shí)驗(yàn)所用樣品購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及山西省太原市某些實(shí)體店。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將上述8種標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光密封存儲(chǔ)（有效期3個(gè)月）。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備中間液：準(zhǔn)確吸取上述2組混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（有效期1周）。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取一定體積的上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備中間液于10 mL容量瓶中，乙腈定容，制得0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（臨用現(xiàn)配）。

2.4 樣品前處理

取0.5 g樣品至50 mL具塞試管中，加入乙腈少量，渦旋震蕩分散，再加入乙腈至35 mL，超聲提取15 min，放冷至室溫，定容。冰浴放置2 h后迅速濾過，即得。

2.5 LC-MS/MS檢測(cè)條件

流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液.所采用的梯度系統(tǒng)程序如下：0～5.5 mim，20%～65%B；5.5～6.5 mim，65%～95%B；6.5～7.5 mim，95%B；7.5～7.6 mim，95%～20%B；7.6～10 mim，20%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：1μL。

質(zhì)譜條件：ESI源；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10L/min；干燥氣流量10 L/min；接口溫度300℃；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。8種抗真菌藥物的保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量等相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 8種抗真菌藥物的LC-MS/MS分析參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了C18和C8 2種色譜柱的分離效果，在相同的流動(dòng)相條件下，采用C18色譜柱時(shí)化合物的分離效果及峰型優(yōu)于C8色譜柱，且C18色譜柱更通用，故選擇C18色譜柱進(jìn)行該項(xiàng)研究。比較了0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)化合物出峰情況，后者系統(tǒng)壓力低、峰型好、響應(yīng)高，選其作為該項(xiàng)研究的流動(dòng)相。

3.2 提取方法的選擇

查閱上述8種抗真菌藥的化學(xué)性質(zhì)、含量測(cè)定方法后[8-10]，初步確定以甲醇、乙腈為提取溶劑進(jìn)行研究?；厥章式Y(jié)果顯示：甲醇為提取溶劑時(shí)，灰黃霉素及酮康唑的提取率低且平行樣相對(duì)誤差大。研究過程中還發(fā)現(xiàn)，部分乳膏基質(zhì)的甲醇或乙腈提取液濾膜過濾后，在室溫較低時(shí)，存在基質(zhì)析出的情況，本實(shí)驗(yàn)將處理好的樣品冰浴放置2 h后，促使乳膏基質(zhì)析出，并于溫度未上升時(shí)迅速濾過，從而減少了液質(zhì)上機(jī)測(cè)試的干擾。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是UPLC-MS/MS法中影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素[11-13]，可采用（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率－1）×100%進(jìn)行評(píng)價(jià)，正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，負(fù)值則表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。|ME（%）|≤20%，認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)弱，可忽略；20%<|ME（%）|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME（%）|＞50%，表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)[14]。由表2可知，8種抗真菌藥物在所測(cè)試的乳膏中基質(zhì)效應(yīng)均小于20%，以弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)為主，且抗真菌藥物需達(dá)到一定劑量才能發(fā)揮藥效，其添加量一般很大（見表3），至少需稀釋上千倍，而溶劑稀釋可進(jìn)一步減弱LC-MS/MS法中基質(zhì)效應(yīng)[14-15]，故本方法中可直接用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

表3 10批次樣品中8種抗真菌藥物的檢測(cè)結(jié)果

3.4 方法學(xué)考察

配制0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化好的條件下進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，以待測(cè)抗真菌藥物質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的定量離子對(duì)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：在0.5～50 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，上述8種抗真菌藥物的r值均大于0.99，線性關(guān)系良好。分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算其方法檢出限和定量下限，檢出限為0.03～0.07 mg/kg，定量下限為0.10～0.20 mg/kg，具體數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 8種抗真菌藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

取0.5 g空白基質(zhì)至50 mL具塞試管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品適量，放至80℃水浴中，待基質(zhì)呈均一液態(tài)時(shí)取出，室溫下基質(zhì)自動(dòng)恢復(fù)半固體狀。加入乙腈適量，渦旋震蕩至分散，再加入乙腈至35 mL，超聲提取15 min，放冷至室溫，定容。冰浴放置2 h后迅速濾過，進(jìn)行精密度、回收率實(shí)驗(yàn)的上機(jī)測(cè)試。結(jié)果顯示：8種抗真菌藥物的回收率為89.3%～113.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于8%。

3.5 樣品測(cè)試

將本方法用于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及實(shí)體店購(gòu)買的10批次樣品進(jìn)行分析測(cè)試，陽(yáng)性樣品量值過大時(shí)用乙腈稀釋至標(biāo)曲濃度范圍內(nèi)。其中，5批次樣品檢出抗真菌藥物，添加種類及其含量如下表所示。從檢測(cè)結(jié)果可知：“消字號(hào)”乳膏中存在添加抗真菌藥物的情況，所添加藥物以臨床常用硝酸咪康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬為主，部分產(chǎn)品甚至同時(shí)添加3種抗真菌藥物?？拐婢幬飸?yīng)在醫(yī)生、藥師等指導(dǎo)下使用，消費(fèi)者未感染真菌或不恰當(dāng)使用此類乳膏，會(huì)對(duì)健康造成損害，應(yīng)引起監(jiān)管部門及消費(fèi)者重視。

4 結(jié)論

本文建立了“消字號(hào)”乳膏中8種抗真菌藥物的檢測(cè)方法，采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀MRM監(jiān)測(cè)模式，樣品以乙腈為提取溶劑，渦旋分散后超聲提取15 min，經(jīng)冰浴除雜后進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。該方法前處理簡(jiǎn)單、試劑耗材用量少、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、可同時(shí)進(jìn)行定性及定量分析，具有較高的實(shí)用價(jià)值。