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    分光光度法測定脂肪酶活性的優(yōu)化研究

    2015-07-27 06:12:27李志紅買旭林義馬煤業(yè)集團煤生化高科技工程有限公司河南三門峽472300
    山東工業(yè)技術(shù) 2015年16期
    關(guān)鍵詞:顯色劑脂肪酶底物

    李志紅,買旭林(義馬煤業(yè)集團煤生化高科技工程有限公司,河南 三門峽 472300)

    分光光度法測定脂肪酶活性的優(yōu)化研究

    李志紅,買旭林(義馬煤業(yè)集團煤生化高科技工程有限公司,河南 三門峽 472300)

    針對該分光光度法,在研究過程中任何一個因素的改變都會對測定結(jié)果造成偏差,為此對各個因素進行了優(yōu)化:體積比為0.25的橄欖油微乳液4ml、酶液1ml、體系溫度35℃、體系pH7.0、反應(yīng)時間20min。在該組合條件下所測酶活數(shù)值為最大。

    脂肪酶;活力測定;分光光度;條件優(yōu)化

    1 概述

    該方法在對不同來源的脂肪酶活力測定較為常見,但由于沒有統(tǒng)一的國家或地方性的標準,該研究對各個條件進行了優(yōu)化,在該體系條件下所測酶活力達到最大,說明此時為最適條件。從而建立一套準確性高、重現(xiàn)性好的脂肪酶活的測定方法[1]。

    2 試劑和溶液

    脂肪酶(食品級,深圳綠微康生物工程有限公司);脂肪酸(分析純,天津市恒津化學(xué)制劑制造有限公司);橄欖油(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);吐溫-80(分析純,上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司);醋酸銅(分析純,天津市恒津化學(xué)試劑制造有限公司);正己烷(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)其他均為國產(chǎn)分析純;0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH =7.5)。

    3 儀器和設(shè)備

    磁力攪拌器、高速離心機、振蕩器、超聲儀、分光光度計等。

    4 試驗

    4.1 顯色劑用量對吸光度的影響

    本方法所用顯色劑使用5%的醋酸銅溶液,加入吡啶并將pH調(diào)至6.1,在波長為710nm時,銅皂在此溶液的吸光度最大,所以此法配制的顯色劑較為理想。但顯色劑的添加量又對最終吸光度的影響較大,添加過少或過多都不能真實反映脂肪酸的生成量。需要試驗以確定顯色劑的添加量[2]。

    根據(jù)本試驗要求,取脂肪酸的苯溶液4ml于100ml錐形瓶中,依次添加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml不同量的顯色劑,磁力攪拌2min,靜止片刻,取上層有機相在710nm波長處測定吸光度,同時以4ml苯作為空白樣。根據(jù)顯色劑用量的曲線圖確定最佳用量。

    4.2 反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響

    酶分子和底物的反應(yīng),在初期速度呈線性,即為酶反應(yīng)的初速度,此階段的時間和產(chǎn)物生成量呈正比,時間的計算才有意義。時間過長,產(chǎn)物產(chǎn)量趨于平緩,再計算平均速度已無實際意義。

    為考察時間對酶反應(yīng)的影響,設(shè)計試驗方案,其他條件如3,反應(yīng)時間分別為10、15、20、25、30min,反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)吸光度計算不同組脂肪酸的產(chǎn)生量。

    4.3 反應(yīng)體系的pH值對測定結(jié)果的影響

    其它條件如3,調(diào)節(jié)緩沖液的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9??疾旆磻?yīng)體系pH對酶活力測定的影響。

    4.4 反應(yīng)體系溫度對測定結(jié)果的影響

    其它條件如3,調(diào)節(jié)水浴溫度分別為25、30、35、40、45、50℃,考察反應(yīng)體系溫度對酶活力測定的影響。

    4.5 底物濃度對測定結(jié)果的影響

    其它條件如3,考察底物濃度(橄欖油)分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35(V/V)時對酶活測定的影響。底物濃度和酶液濃度的最佳值都是相對而言的,由于酶促催化反應(yīng)存在酶飽和現(xiàn)象,當橄欖油濃度低時,脂肪酶沒有完全被橄欖油飽和,因而酶活力隨著底物濃度的增大而增加。當?shù)孜餄舛冗_到一定值后,脂肪酶被完全飽和,隨著底物濃度增大而酶促反應(yīng)速率開始放緩,此時可測得最大酶活。

    5 結(jié)果與討論

    5.1 顯色劑用量對吸光度的影響

    分別測得顯色劑在不同添加量0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml時的吸光度分別為0.801、0.843、0.877、0.881、0.889、0.902 L/(g.cm)。以吸光度為縱軸、顯色劑用為橫軸作圖,得到圖1所示顯色劑用量-吸光度曲線圖,從曲線中看出當用量達到1.0ml時吸光度增大不明顯,因此選取1.0ml較為合適[3]。

    5.2 反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響

    反應(yīng)分別進行10、15、20、25、30 min后測得脂肪酸的濃度為10、14、18、21、23 μmol/L。以脂肪酸濃度對反應(yīng)時間作圖,即得到圖2所示曲線,由圖可看出,反應(yīng)前25min曲線呈線性,該段時間內(nèi)酶促反應(yīng)處于初速度階段,而為了檢驗步驟的簡便,同時在保證結(jié)果準確的情況下,選取20min為宜。

    5.3 反應(yīng)體系的pH值對測定結(jié)果的影響

    該組試驗分別在pH為3、4、5、6、7、8、9條件下進行,通過對緩沖溶液調(diào)節(jié)酸堿度實現(xiàn),經(jīng)過反應(yīng)后得到的結(jié)果以百分比的形式表示,以測得酶活的最大值為100%,結(jié)果分別為21%、44%、79%、88%、97%、86%、15%。用百分比對pH作圖,得到如圖3所示曲線,由圖可看出反應(yīng)最適pH為7,較低或較高的酸堿度都對結(jié)果影響較大。

    5.4 反應(yīng)體系溫度對測定結(jié)果的影響

    該組試驗分別設(shè)置不同的溫度進行反應(yīng),分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃,經(jīng)過反應(yīng)后得到的結(jié)果以百分比的形式表示,以測得酶活的最大值為100%,結(jié)果分別為51%、93%、98%、89%、58%、5%,用百分比對溫度作圖,得到如圖4所示曲線,由圖可看出反應(yīng)的最適溫度為35%左右,30%以下、45%以上酶的活力急劇下降降幅在50%左右,這是由于高溫下酶分子的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,酶失去活性,不再具有降低反應(yīng)活化能的功能,而溫度過低自然會降低酶反應(yīng)的速率[4]。

    5.5 底物濃度對酶活測定的影響

    該組反應(yīng)分別添加不同量的橄欖油,分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35(v/v),反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸濃度分別為1.10、1.40、1.62、1.90、2.11、2.20 μmol/L.min。以脂肪酸濃度對底物濃度作圖,得到如圖5所示曲線,由圖可看當?shù)孜餄舛瘸^0.3時反應(yīng)速度增加緩慢,不呈線性關(guān)系,為了保證結(jié)果的準確性,選取0.25為添加濃度[5]。

    5.6 注意事項

    (1)固體酶粉的處理應(yīng)確保酶分子充分浸提,稀釋定容過程中應(yīng)防止交叉污染,否則對結(jié)果的影響較大。酶液配制完成后應(yīng)在12h內(nèi)使用。

    (2)試驗過程中發(fā)現(xiàn),形成微乳液的水來自酶液,而水含量對酶活又有較大影響,因此酶液的體積應(yīng)準確控制。同時,試驗中為降低反應(yīng)體系中水的生成量,可采用在低壓環(huán)境下進行。

    6 結(jié)論

    該方法采用分光光度法,與滴定法相比較而言有較高的靈敏度和可重復(fù)性,失誤率也較低,可作為脂肪酶活性測定的一個可靠方法。不足之處是該方法的反應(yīng)條件有待更加嚴謹?shù)拇_定,可以采用正交分析法或響應(yīng)面分析法,設(shè)計出多因素、多水平、數(shù)據(jù)更加精確的數(shù)據(jù),綜合分析出最優(yōu)的組合,從而使結(jié)果更加接近真實值。該方法的研究也在一定程度上對酶促反應(yīng)的基本理論的完善奠定了基礎(chǔ),為行業(yè)進一步提高脂肪酶檢測的效率和準確率做出了貢獻。

    [1]鄭毅,葉海梅.脂肪酶活力測定研究進展.工業(yè)微生物,2005,35(04):36.

    [2]張海燕,丁玉.脂肪酶活力測定的最新研究.生物學(xué)通報,2007,42(03):16.

    [3]廖朝暉.在有機介質(zhì)中固定化脂肪酶反應(yīng)特性及其動力學(xué)研究.南昌大學(xué)學(xué)報(理科版),2000,24(04):326-331.

    [4]五校合編.有機化學(xué)[M].高等教育出版社,1986.

    李志紅(1981-),本科,助理工程師,研究方向:生物科學(xué)。

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