光透明劑控制生物組織光學(xué)特性的研究

郭 曉（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心,廣州 510000）

光透明劑控制生物組織光學(xué)特性的研究

郭 曉
（國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心,廣州 510000）

光透明劑是一種高折射率的生物相容性的化學(xué)試劑，光透明劑控制生物組織光學(xué)特性是最近發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，通過(guò)施加甘油、葡萄糖、甘露醇、丙二醇、甘油等光透明劑來(lái)改善生物組織對(duì)光的散射，可以有效地提高光在組織中的穿透深度，增加組織的成像深度和對(duì)比度。本論文綜述了目前光透明劑的種類和光透明特性以及光透明劑控制生物組織光學(xué)特性的原理和測(cè)量方法，并簡(jiǎn)述了光透明技術(shù)的應(yīng)用前景。

光透明技術(shù)；組織光學(xué)特性控制；光透明劑;生物組織

1 引言

近年來(lái)，隨著激光生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，光學(xué)方法在醫(yī)學(xué)診斷及應(yīng)用上也越來(lái)越廣泛，測(cè)定光在生物組織傳播的光學(xué)特性也變得越來(lái)越重要，研究光子與生物組織相互作用后的光學(xué)特性能夠極大推動(dòng)激光在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用和發(fā)展，對(duì)探索生物組織的新陳代謝、腫瘤病變狀態(tài)等也具有重要的研究意義[1]。然而，由于生物組織在生物醫(yī)學(xué)上被看作為是渾濁介質(zhì)，其對(duì)可見(jiàn)光和近紅外波長(zhǎng)具有很強(qiáng)的散射效應(yīng)，這種強(qiáng)的散射特性限制光在組織的穿透深度和成像的對(duì)比度，這樣使得光子技術(shù)只能用于活體淺表組織，從而降低了光在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的檢測(cè)、成像的運(yùn)用以及治療效果。

為了解決這一問(wèn)題，Tuchin等[2]在1997年首次提出了用光透明技術(shù)來(lái)減少生物組織中光的散射。即采用高滲透試劑——具有高滲透壓的溶液，例如葡萄糖、甘露醇、丙二醇、甘油等對(duì)組織進(jìn)行光學(xué)滲透，提高組織內(nèi)部的折射率匹配，從而有效地減少組織的光散射，增加光穿透深度，提高成像質(zhì)量。這種技術(shù)即為組織透明（tissue clearing）[3]，在組織透明過(guò)程中所使用的高折射率的生物相容性的化學(xué)試劑被稱為光透明劑（optical clearing agent）。組織光透明適用于很多不同的生物樣品，如人的腦膜、角膜、皮膚、血液、大腦皮層和胃等[3]。本文綜述了當(dāng)今光透明劑控制生物組織光學(xué)特性的最新研究概況及其應(yīng)用前景。

2 生物組織光透明的應(yīng)用研究

2.1 光譜法

通過(guò)對(duì)離體組織的漫反射光譜檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于波長(zhǎng)為500和630 nm附近的吸收峰在組織癌變前后存在著明顯的差別，這是由于癌變組織中含有比正常組織更多的血液量，且癌變組織一般都要消耗更多的氧，所以去氧血紅蛋白的含量大大增多，這為我們利用可見(jiàn)光的漫反射光譜分析組織的特性提供了依據(jù)，可見(jiàn)，通過(guò)漫反射光譜可簡(jiǎn)便、快速地鑒別組織的癌變。朱等用光譜法研究了不同濃度甘油作用于小鼠皮膚后其光譜的變化。

目前國(guó)內(nèi)外也已有相當(dāng)多的研究小組用光譜法來(lái)研究光透明劑對(duì)組織透明性的改變。Alexey等用光譜法研究了葡萄糖溶液對(duì)在體皮膚光透明性的影響，其實(shí)驗(yàn)裝置如圖1，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

其研究采用反射光譜法探測(cè)，用40%的葡萄糖溶液采用皮內(nèi)注射的方法注射入皮膚，結(jié)果表明，皮膚更加透明，從而增加了光滲透入組織的能力。

圖2 人的在體皮膚經(jīng)作用后葡萄糖不同時(shí)刻光譜圖

圖3 針表面標(biāo)準(zhǔn)化的背向散射光強(qiáng)度

2.2 OCT法

由于光譜法不能測(cè)量不同深度處的光學(xué)參數(shù)，光學(xué)相干層析成像（OCT）技術(shù)卻可以實(shí)現(xiàn)不同深度的實(shí)時(shí)測(cè)量，能夠獲得組織微觀結(jié)構(gòu)的高分辨橫截面成像，但是成像深度僅為10-20微米，所以，近年來(lái)越來(lái)越多的采用OCT研究光透明劑控制組織光學(xué)特性的報(bào)道。徐等采用超聲誘導(dǎo)的方式使光透明劑更有效的進(jìn)入組織，同時(shí)采用OCT法來(lái)檢測(cè)光透明劑作用于組織前后組織的光學(xué)特性的改變，研究表明，離體的皮膚組織和在體的皮膚組織分別用60%的甘油和60%甘油與超聲共同作用后用OCT對(duì)組織進(jìn)行成像，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3，圖4所示。

圖1 光譜法檢測(cè)葡萄糖對(duì)組織通透效果的實(shí)驗(yàn)裝置圖

研究表明，在沒(méi)有甘油作用時(shí)，OCT的成像深度大約為1.3 mm，在甘油和超聲共同作用后，采用OCT法不僅能測(cè)出滲透率和光透明度，而且可以區(qū)分上皮組織的不同層結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，光透明劑和光學(xué)相干層析成像技術(shù)結(jié)合可以很好地應(yīng)用于眼科的診斷和治療。

圖4 甘油和甘油與超聲共同作用后的皮膚組織標(biāo)準(zhǔn)化光學(xué)厚度

2.3 二次諧波成像法

光透明劑對(duì)生物組織背向二次諧波成像影響的研究現(xiàn)正在起步當(dāng)中，SHG成像法能夠降低OCT成像中的一些限制因素，所以SHG不管是在研究還是臨床應(yīng)用方面都有很大優(yōu)勢(shì)。

由于組織的厚度和激光光斑直徑在μm量級(jí)，樣品的透射光強(qiáng)可根據(jù)修正的比爾-朗伯定律描述光強(qiáng)的衰減， z為掃描深度，I0為樣品表面的信號(hào)強(qiáng)度，I（z）為深度z處樣品的信號(hào)強(qiáng)度，處的二次諧波信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算I0，二次諧波信號(hào)強(qiáng)度可通過(guò)系統(tǒng)自帶工具Histo獲得。以上公式變換[5]為:

所以，相對(duì)于在磷酸緩沖液（PBS）中，浸泡在甘油中的動(dòng)脈血管組織的全衰減系數(shù)大約減少了51%。

2.4 共焦顯微鏡法

從上世紀(jì)80年代起，激光顯微光譜分析技術(shù)逐步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中，來(lái)對(duì)生物組織進(jìn)行成像，其是在熒光成像的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，用光源出射的光準(zhǔn)確地入射到位于共軛點(diǎn)處的被測(cè)物，可以獲得更高的對(duì)比度和不同組織深度的信息，共聚焦顯微成像技術(shù)把光學(xué)成像的分辨率提高了百分之三十到百分之四十。將光譜分析技術(shù)結(jié)合在共聚焦掃描顯微成像技術(shù)和光譜技術(shù)的顯微光譜分析法中可以更加準(zhǔn)確地檢測(cè)早期癌變。這種成像技術(shù)也面臨掃描深度的問(wèn)題，所以也常將其和光透明技術(shù)相結(jié)合來(lái)進(jìn)行癌癥檢測(cè)研究。Meglinski等在2003年提出一個(gè)理論模型來(lái)模擬皮膚被光透明劑作用時(shí)，其共聚焦顯微成像能達(dá)到的最大深度，此理論模型是基于Monte Carlo模型的，檢測(cè)了在使用甘油0min、10min和20min時(shí)共聚焦探測(cè)器在300，600 和900 μm處測(cè)得的信號(hào)分布圖，經(jīng)分析比較可以看出甘油作用于組織后，其共聚焦的成像深度幾乎增加了3倍，可見(jiàn)，共聚焦成像技術(shù)能夠很好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)診斷和激光治療。

2.5 雙光子顯微成像

雙光子顯微成像技術(shù)是結(jié)合共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)，其克服了傳統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡依賴小孔光闌成像對(duì)熒光收集效率的強(qiáng)烈損失、焦平面外的激發(fā)區(qū)域背景熒光干擾和光生物損傷區(qū)域大的確定，采用在輻照光路中標(biāo)記多個(gè)熒光標(biāo)記物，但只有處在聚焦光焦點(diǎn)處的標(biāo)記物才能發(fā)出熒光，而且其分辨率可以達(dá)到亞微米尺度，而且，雙光子過(guò)程的激發(fā)光的波長(zhǎng)可設(shè)計(jì)在生物光學(xué)窗口的范圍內(nèi)，避開(kāi)了生命體系所不能承受的紫外一可見(jiàn)光損傷。所以目前也有相關(guān)研究采用雙光子顯微成像來(lái)對(duì)光透明劑作用后的組織進(jìn)行成像。Cicchi等在2005年的研究表明，在人的離體真皮組織中施加甘油，丙二醇和葡萄糖這些光透明劑前后圖像總的強(qiáng)度和對(duì)比度在增加，雙光子顯微成像的成像深度和對(duì)比度得到明顯的改善，并且在成像完成后將各個(gè)樣品放入磷酸緩沖液后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葡萄糖作用過(guò)的組織樣品是可逆的。

3 生物組織光透明研究的展望

激光應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床上的治療和診斷以及光學(xué)成像技術(shù)的是當(dāng)前快速發(fā)展的國(guó)際前沿領(lǐng)域，然而，由于光在入射到生物組織上時(shí)同時(shí)存在反射、折射、吸收和散射的效應(yīng)，來(lái)對(duì)光束在生物組織中的傳播產(chǎn)生干擾，從而限制了光在生物組織中的穿透深度，使得光子技術(shù)只能應(yīng)用于活體組織的淺表部位，因此，深入研究不同光學(xué)透明劑在不同生物組織的中的滲透速率是十分必要的。生物組織的光透明機(jī)理的研究有助于其在醫(yī)學(xué)診斷實(shí)用中針對(duì)目標(biāo)組織選取合適的有效光透明劑，從而達(dá)到更好的、更準(zhǔn)確的醫(yī)學(xué)診斷結(jié)果?？梢?jiàn)，生物組織光透明性的研究不僅有助于了解光透明的作用機(jī)制，也有利于光子儀器在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，可為臨床醫(yī)學(xué)診斷提供針對(duì)目標(biāo)組織實(shí)現(xiàn)光透明的有效途徑，其研究成果有望在不遠(yuǎn)的將來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療。

[1]WEI Huajiang,XING Da,LU Jianjun el at.Total attenuation coefficients of human bladder at different lasers measured by using the direct and indirect methods in vitro[J].LASER TECHNOLOGY,2005,29（4）:420-422（in chinese）.

[2] Valery V.Tuchin,Irina L.Maksimova,Dmitry A.Zimnyakov et al.Light Propagation In Tissues With Controlled Optical Properties[J].JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS,1997,2（4）:401-407.

[3] SUN Hui-xia,LI Peng,HE Yong-hong el at.A Study of the Optical Clearing by OCT[J]. ACTA LASER BIOLOGY SINICA,2007,16（5）:521-526（in chinese）.