轉化生長因子β1聯(lián)合生長分化因子—5體外誘導骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化的實驗研究

邢峰　馬迅

[摘要] 目的 探討轉化生長因子β1聯(lián)合生長分化因子-5體外誘導骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化的可能性。 方法 取SD大鼠骨髓間質干細胞，流式細胞儀檢測兩種干細胞CD105、CD90、CD44、CD29、CD45、CD34、CD24的表達。將增殖至第三代的BMSCs分為對照、TGF-β1、GDF-5、TGF-β1+ GDF-5四組，分別以含不同細胞因子誘導液培養(yǎng)14d后，采用RT-PCR檢測各組細胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX-9基因的表達。 結果 兩種干細胞CD105、CD90、CD44、CD29表達陽性； CD45、CD34、CD24表達陰性。向類髓核細胞誘導培養(yǎng)14d后，TGF-β1、GDF-5、TGF-β1與GDF-5三組的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平較對照組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合誘導組經(jīng)過誘導后的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平明顯高于TGF-β1組及GDF-5組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 GDF-5與TGF-β1都具有誘導BMSCs向類髓核細胞分化的能力，且二者之間具有協(xié)同作用，聯(lián)合應用可以更好的誘導BMSCs向類髓核細胞分化。

[關鍵詞] 轉化生長因子β1；生長分化因子-5；骨髓間質干細胞；類髓核細胞；椎間盤；Ⅱ型膠原

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2015）11-20-05

[Abstract] Objective To explore the possibility of transforming growthβ1 combined with growth differentiation factor-5 inducing bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into nucleus pulposus-like cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were taken from Sprague-Dawley rats and flow cytometer was used to detect the expression of CD105， CD90， CD44， CD29， CD45， CD34 and CD24 of two kinds of stem cells. BMSCs proliferating to the third generation were divided into control group， TGF-β1 group， GDF-5 group and TGF-β1+ GDF-5 group. After 14 days' cultivation of inducing medium of different cytokines， RT-PCR were used to detect the expression of collagen typeⅡ， proteoglycan and SOX-9 genes in every group. Results The CD105， CD90， CD44 and CD29 of two kinds of stem cells had positive expressions while CD45， CD34 and CD24 of two kinds of stem cells had negative expressions. After 14 days' inducing cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells， gene expression levels of Collagen typeⅡ， Aggrecan and SOX-9 in TGF-β1 group、GDF-5 group and TGF-β1+ GDF-5 group were significantly increased than those in the control group. The difference was statistically significant （P<0.05）. The gene expression level of Collagen type Ⅱ， Aggrecan and SOX-9 in TGF-β1+ GDF-5 group were significantly higher than that in TGF-β1 group and GDF-5 group. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion TGF-β1 and GDF-5 both have the ability to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into nucleus pulposus-like cells and there is synergistic effect between them. The combined application can better induce BMSCs to differentiate into nucleus pulposus-like cells.

[Key words] Transforming growth factor β1； Growth differentiation factor-5； Bone marrow mesenchymal stem cells； Nucleus pulposus-like cells； Intervertebral disk； Collagen type Ⅱ

脊柱退行性疾病是嚴重危害人類健康和生命的重要疾病，椎間盤退變（intervertebral disc degenerative diseases，DDD）是其主要的病理改變。傳統(tǒng)保守治療和手術治療方法只然能緩解臨床癥狀，并不能從根本上緩解椎間盤的退變。近年來隨著生物技術的發(fā)展，以細胞治療為基礎的生物治療技術為椎間盤退變性疾病提供了一種新的治療策略。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchyme stem cells，BMSCs）具有向多種細胞分化的能力，合適的微環(huán)境及環(huán)境中相關細胞因子的存在是BMSCs定向分化的前提。轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）是軟骨及髓核組織工程中常用的細胞因子，能夠誘導BMSCs 向類軟骨細胞和類髓核細胞分化，并且在軟骨形成過程中有著重要的作用。生長分化因子-5（growth and differentiation factor-5）也稱為軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的一員，具有促進軟骨形成和發(fā)育的能力。本實驗旨在探討轉化生長因子β1聯(lián)合生長分化因子-5體外誘導骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化的可能性，為髓核組織工程研究提供相關理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

SD大鼠骨髓間質干細胞成軟骨誘導培養(yǎng)液（Cyagen，美國）；重組人TGF-beta1（PeproTech，美國）；重組人GDF-5（PeproTech，美國）；熒光定量試劑盒（TaKaRa，日本）；7300熒光實時定量PCR擴增儀（Applied Biosystems，美國）。

1.2 BMSCs的分離與培養(yǎng)

無菌條件下，取SD大鼠股骨骨髓，200目濾網(wǎng)過濾去除殘留組織，PBS沖洗3次，加入20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打均勻，計數(shù)后，按細胞密度為1×104/L接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天換液1次，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。原代培養(yǎng)細胞達到80%～90%融合時，加入質量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化，計數(shù)后按1∶2分瓶傳代。

1.3 流式細胞術進行表面免疫表型鑒定

取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化，每管取1mL濃度為1×105/mL的細胞，PBS洗滌，棄上清用于標記。每種細胞均設同型對照（IgG1-PE抗體），其余測定管中分別加入熒光單克隆抗體CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24（熒光染料均為PE），混勻后室溫避光孵育30min， PBS清洗，重懸于500μL PBS（含質量濃度為1%的多聚甲醛），BACKMAN FC500型流式細胞儀檢測。根據(jù)同型對照的熒光強度設定陰性細胞群閾值，觀察各組陽性細胞表達率及熒光強度。

1.4 BMSCs向類髓核細胞誘導分化

1.4.1 實驗分組 （1）對照組；（2）TGF-β1組；（3）GDF-5組；（4）TGF-β1+ GDF-5組。

1.4.2 培養(yǎng)基配置 （1）無血清低糖DMEM、1mM丙酮酸鈉、0.1mM維生素C、10-7M地塞米松；（2）（1）+10ng/mL重組人TGF-β1；（3）（1）+100ng/mL重組人GDF-5；（4）（1）+10ng/mL重組人TGF-β1+100ng/mL重組人GDF-5。

1.4.3 向類髓核細胞誘導分化方法 分別取脂肪、髓核來源第3代間充質干細胞，胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，細胞計數(shù)板計數(shù)，轉移到15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，每7.5×105個細胞用1mL不完全誘導液重懸，1000rpm離心5min，棄上清，用完全誘導液以5×105/mL的濃度重懸，每0.5毫升細胞懸液分裝入15mL離心管中，1000rpm離心5min，將離心管蓋擰緊后松開半圈，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置24h。每2～3天完全換液，換液后輕彈離心管底部，使細胞球懸浮。每2～3d換液1次，按照時間分組連續(xù)誘導14d。

1.5 SYBR green法熒光定量PCR分析

誘導完成后，以Trizol法提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度，按照RT試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，按照SYBR green熒光定量RT-PCR試劑盒說明，反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，Rox DyeⅡ 0.4μL，上游引物 0.8μL，下游引物 0.8μL，cDNA 2μL，去離子水：6μL。反應條件：90℃預變性10s，隨后90℃變性5s，60℃延伸40s，共40個循環(huán)。采用ΔΔCt法，即以β-actin為內參照基因，計算各樣品ΔCt（目的基因 Ct-內參基因Ct），設定某一正常對照ΔCt值為校正樣品，計算ΔΔCt（各樣品ΔCt-校正品ΔCt），某樣品的目的基因mRNA相對表達量（RQ）可用如下公式計算：RQ=2-ΔΔCt每一樣品均設2個重復孔，計算其均值作為RQ值。每次PCR反應后均進行熔解曲線分析以確認擴增產(chǎn)物的特異性。

目的基因和內參照基因的引物序列如下： Aggrecan（ACAN）引物序列如下：上游引物5′-CCACTGGAGAGGACTGCGTAG-3′，下游引物5′- GGTCTGTGCAAGTGATTCGAG -3′。Type II collagen_1（COL2A1）引物序列如下：上游引物5′-GGAAGAGTGGAGACTACTGGATTGAC-3′，下游引物5′-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-3′。Sex-determining region Y box 9 （SOX-9）引物序列如下：上游引物5′- AGGAAGCTGGCAGACCAGTACC-3′，下游引物5′- GGGTCTCTTCTCGCTCTCGTTCA-3′。內參基因b-actin引物序列如下：上游引物：5′- TCCTAGCACCATGAAGATC-3′，下游引物：5′-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3′。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結果以（）表示。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 干細胞的分離與培養(yǎng)

原代細胞3～4d貼壁，細胞形態(tài)以短梭形居多，少量為三角形及多邊形，形態(tài)飽滿，胞核明顯，折光性好；15～20d達到90%融合，傳至第3代，細胞形態(tài)均一、排列緊密，呈螺旋狀生長。見圖1。

2.2 干細胞的鑒定

流式細胞術檢測BMSCs結果顯示CD105、CD90、CD44、CD29均為陽性；造血干細胞標志CD45、CD34均為陰性；成熟髓核細胞標志物CD24均為陰性。見圖2。

2.3 細胞外基質相關基因的表達

各組誘導14d后，采用Realtime PCR對各組Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因進行定量檢測，結果顯示，TGF-β1（2）、GDF-5（3）、TGF-β1與GDF-5（4）三組的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平較對照組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合誘導（4）組經(jīng)過誘導后的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平明顯高于TGF-β1（2）組及GDF-5（3） 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TGF-β1（2）組與GDF-5（3）組Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

椎間盤退行性病變引起的頸肩、腰腿痛在臨床骨科十分常見[1]。造成椎間盤退行性變的主要原因通常認為是中央髓核的退變所致，細胞減少且功能退化，髓核脫水，合成蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白能力減弱，且難以自行逆轉[2-3]。目前臨床常規(guī)手術如髓核摘除、人工椎間盤置換等雖然可以緩解病痛，卻難以完全模擬和替代髓核復雜的生物力學功能，同時還存在并發(fā)癥和遠期療效不佳的問題，故更不宜應用于椎間盤退變的早期治療。組織工程技術的日益發(fā)展和成熟，為解決上述難題帶來了希望。研究表明轉化生長因子β1與生長分化因子-5均具有體外促進骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化的能力，然而二者聯(lián)合誘導骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化效果如何目前未見相關報道。因此，本實驗通過探討轉化生長因子β1聯(lián)合生長分化因子-5體外誘導骨髓間質干細胞向類髓核細胞分化的可能性，為髓核組織工程研究提供相關理論與實驗依據(jù)。

2004年，Risbud等[4]首次以包含TGF-β1的培養(yǎng)基在低氧條件下將BMSCs在體外誘導分化為類髓核細胞表型，使其髓核細胞轉錄產(chǎn)物蛋白多糖、Ⅱ型膠原及SOX9表達均顯著增高[5]，證實了TGF-β具有在體外誘導干細胞向類髓核細胞分化的能力，如今TGF-β的利用已成為體外誘導干細胞向類髓核細胞分化最常使用的方法之一[6-9]。

生長分化因子-5也稱為軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的一員， 作用于骨骼系統(tǒng)，具有促進軟骨形成和發(fā)育的能力。其具有多種調節(jié)功能，可用于軟骨、骨、關節(jié)、肌腱、韌帶、椎間盤等的組織工程研究與治療。Wang 等[10]將帶有CDMP-1及TGF-β的腺病毒分別轉染到兔和人椎間盤細胞中，結果顯示CDMP-1與TGF-β過表達可以促進椎間盤細胞的增殖以及細胞外基質的合成。Maitre等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，退變人髓核細胞在包含GDF-5的誘導液培養(yǎng)后蛋白多糖與Ⅱ型膠原基因表達增高，且蛋白多糖產(chǎn)物增多。

髓核細胞外基質主要由膠原纖維和蛋白聚糖構成， 髓核細胞的主要功能是分泌膠原蛋白和酸性粘多糖[12]，其中Ⅱ型膠原占大部分，它和聚集蛋白聚糖、SOX-9被認為是髓核細胞的特征性標志[5]，且在國內外眾多學者的研究當中作為干細胞向類髓核細胞誘導分化的評定標準[7-8，13-15]。本實驗分別用包含TGF-β1、GDF-5、TGF-β1與GDF-5，及無細胞因子4種誘導液誘導BMSCs向類髓核細胞分化，大體觀察誘導48h后，TGF-β1、GDF-5、TGF-β1與GDF-5三組離心管中的細胞均形成細胞球，第一次換液后輕彈離心管底部，細胞球懸浮于誘導液中，而對照組離心管中無細胞球形成。熒光定量PCR測定細胞外基質相關基因蛋白多糖、Ⅱ型膠原及SOX-9的表達，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，單因素方差分析結果顯示， TGF-β1（2）、GDF-5（3）、TGF-β1與GDF-5（4）三組的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平較對照組均有明顯升高，聯(lián)合誘導（4）組經(jīng)過誘導后的Collagen type Ⅱ、Aggrecan、SOX-9基因表達水平明顯高于TGF-β1（2）組及GDF-5（3）組，表明GDF-5與TGF-β1都具有誘導BMSCs向類髓核細胞分化的能力，且二者之間具有協(xié)同作用，聯(lián)合應用可以更好的誘導BMSCs向類髓核細胞分化。

體外誘導BMSCs向類髓核細胞表型分化是一個復雜的過程，適宜的微環(huán)境、細胞因子以及誘導方法是其分化的必要條件。因此，需探索合適的細胞因子組合及其濃度才能達到最佳的誘導分化效果，以構建更加優(yōu)質的組織工程化髓核。另外，有必要從分子水平進一步探索BMSCs向類髓核細胞誘導分化的信號傳導和分化機制， 以及如何長期維持誘導后的髓核細胞表型，在低氧、低糖、低PH、高滲透壓為特點的椎間盤內環(huán)境下其生存、增值，以及向類髓核細胞誘導分化的能力如何，這些都有待于進一步的研究。

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（收稿日期：2015-02-13）