4種常見水果協(xié)同清除自由基能力的比較

陳琳琳，謝志新，許嶸，郭幼紅（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建泉州362000）

4種常見水果協(xié)同清除自由基能力的比較

陳琳琳，謝志新，許嶸，郭幼紅
（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州362000）

摘要：采用比色法對(duì)葡萄、西柚、檸檬、蘆柑4種常見水果清除自由基的能力進(jìn)行測(cè)定和比較，并對(duì)其兩兩組合的清除自由基能力的協(xié)同作用進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，對(duì)羥自由基及超氧陰離子抑制能力最強(qiáng)的是檸檬，SOD活力最強(qiáng)的是檸檬。在抗氧化協(xié)同作用上，4種水果兩兩組合除在清除羥自由基能力上出現(xiàn)個(gè)別負(fù)協(xié)同現(xiàn)象，在清除超氧陰離子和增加SOD活力上均為正協(xié)同作用，且協(xié)同增效作用較為明顯。

關(guān)鍵詞：水果；自由基；協(xié)同作用

自由基，也稱“游離基”，是化合物在外界條件作用下形成的具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物，生命體內(nèi)的自由基是與生俱來(lái)的，正常的代謝過(guò)程均會(huì)有自由基的產(chǎn)生，適量的自由基對(duì)生命活動(dòng)是必需的，但過(guò)多的自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生許多傷害[1]。炎癥、腫瘤、衰老、血液等疾病的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系[1-11]。生物體內(nèi)常見的自由基有：羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、氫自由基（H·）、有機(jī)自由基（R·）等[12]。尋找降低自由基對(duì)人體損害的物質(zhì)成為了熱點(diǎn)，隨著科學(xué)的發(fā)展和人們觀念的轉(zhuǎn)變，食用安全又具有保健作用的食物來(lái)清除過(guò)剩的自由基已成為現(xiàn)代人關(guān)注的焦點(diǎn)。而水果不僅能提供給我們每日所需的維生素、礦物質(zhì)，而且還是天然抗氧化劑的資源，較化學(xué)合成的抗氧化劑有明顯的優(yōu)點(diǎn)[13]。

任何相同或不同的物質(zhì)之間都存在著相互作用，有的作用方向一致，達(dá)到彼此增強(qiáng)的效果，稱為協(xié)同作用；有的作用方向相反，產(chǎn)生互相排斥抵消的效果，稱為拮抗作用；有的互不干擾。研究表明，有些抗氧化物質(zhì)復(fù)合后比單一存在時(shí)，抗氧化活性高；但也有研究發(fā)現(xiàn)，多種抗氧化活性物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，其抗氧化活性反而降低[14]?；诖?，選取日常生活中常見且常食用的4種水果進(jìn)行協(xié)同配伍研究，探索最佳的抗氧化劑組合對(duì)于人類健康具有重大意義。

1　材料與方法

1.1材料

葡萄、檸檬、自由、蘆柑4種水果：泉州；羥自由基測(cè)定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；乙酸、無(wú)水乙醇等均為分析純：廣州西隴化工。

1.2設(shè)備

賽多利斯BSA223S電子天平：德國(guó)賽多利斯；TG16-WS臺(tái)使高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司；DK450B型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；752型分光光度計(jì)：上海光譜儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品采集與處理

所有樣品先用自來(lái)水清洗3遍再用蒸餾水沖洗3遍，取日常食用部位，勻漿搗碎，5 000 r/min離心15 min，離心所得上清液即為所需樣品。

1.3.2抑制羥自由基能力測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的羥自由基測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，求其平均值。具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

定義：每毫升樣品在37℃水浴下反應(yīng)1min使反應(yīng)體系中H2O2的濃度降低1mmol/L為一個(gè)抑制羥自由基能力單位（U/mL）。計(jì)算公式：

式中：A對(duì)照為蒸餾水及底物應(yīng)用液的吸光值；A樣品為樣品的吸光值；A標(biāo)準(zhǔn)為0.03%過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的吸光值；A空白為蒸餾水的吸光值；標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為8.824mmol/L；N為樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.3抑制超氧陰離子自由基（O2·-）能力測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)以0.15mg/mLVC作為樣品對(duì)照，以蒸餾水做空白對(duì)照，具體操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，求其平均值。

定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每毫升樣品在37℃下反應(yīng)40min所能抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1mg的VC所能抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位。

式中：A對(duì)照為蒸餾水及試劑盒試劑一的吸光值；A樣品為樣品的吸光值；A標(biāo)準(zhǔn)為0.15mg/mLVC標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值；標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為0.15mg/m L；N為樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.4SOD活力測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。具體操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，求其平均值。

定義：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。計(jì)算公式：

式中：A對(duì)照為蒸餾水的吸光值；A樣品為樣品的吸光值；N1為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)；N2為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.5協(xié)同作用分析

目前，用于協(xié)同抗氧化作用體系評(píng)價(jià)的方法主要有3種[15]。一是加和法[16-17]，通過(guò)比較復(fù)合前后物質(zhì)抗氧化能力的大小。若復(fù)合后抗氧化活性比復(fù)合前抗氧化活性高，那么兩物質(zhì)之間稱為正協(xié)同，反之，稱為負(fù)協(xié)同；二是比較法，通過(guò)比較同濃度下復(fù)合前后物質(zhì)之間的抗氧化活性。三是響應(yīng)曲面法。本次研究，在抑制自由基能力測(cè)定的基礎(chǔ)上，選擇最佳濃度或取樣量，采用加和法，通過(guò)比較兩兩復(fù)合后與單一存在下的抗氧化活性，判斷是否存在協(xié)同作用。

2　結(jié)果與分析

2.14種水果抑制羥自由基能力比較

4種水果抑制羥自由基能力的比較見圖1和圖2。

圖1　不同濃度下4種水果抑制羥自由基能力比較Fig.1　Comparison ofhydroxyl radical inhibiting ability of fou rcomm on fruit in different concentration

圖2　4種水果抑制羥自由基能力比較Fig.2　Comparison of hydroxyl radical inhibiting ability of four comm on fruit

隨著濃度的增大，4種水果抑制羥自由基的能力均增強(qiáng)，在相同濃度下，抑制羥自由基能力的順序?yàn)闄幟剩疚麒郑咎J柑＞葡萄，通過(guò)圖2可以看出，4種水果中，檸檬抑制羥自由基的能力最強(qiáng)，其抑制羥自由基的能力為91 718.68U/mL，而葡萄抑制羥自由基的能力最弱，其抑制羥自由基的能力為1 735.14U/mL，西柚和蘆柑抑制羥自由基的能力分別為12 936.43 U/m L 和8 973.35U/mL。

2.24種水果抑制超氧陰離子自由基能力比較

4種水果抑制超氧陰離子自由基能力的比較見圖3和圖4。

圖3　不同濃度下4種水果抑制超氧陰離子能力比較Fig.3　Comparison of superoxideanion inh ibiting ability of four common fruit in differentconcentration

圖4　4種水果抑制超氧陰離子能力比較Fig.4　Comparison of superoxideanion inhibiting ability of four common fruit

隨著濃度的增大，4種水果抑制超氧陰離子的能力均增強(qiáng)，通過(guò)圖4可以看出，4種水果中，在最佳條件下，抑制超氧陰離子能力的順序?yàn)闄幟剩疚麒郑咎J柑＞葡萄，檸檬抑制超氧陰離子的能力最強(qiáng)，其抗超氧陰離子活力為2 462.86U/L，而葡萄抑制超氧陰離子的能力最弱，其抗超氧陰離子活力為750 U/L，西柚和蘆柑抗超氧陰離子活力分別為1592.86U/L和1193.88U/L。

2.3 4種水果總SOD活力比較

4種水果總SOD活力的比較見圖5和圖6。

由圖可知，隨著濃度的增大，4種水果總SOD活力均增強(qiáng)。在相同濃度下，總SOD活力的順序?yàn)闄幟剩疚麒郑酒咸眩咎J柑，通過(guò)圖6可以看出，在最佳取樣量條件下，4種水果中，檸檬總SOD活力最強(qiáng)，其總SOD活力為951.22U/g組織濕重，而蘆柑SOD活力最弱，其總SOD活力為66.95 U/g組織濕重，西柚和蘆柑總SOD活力分別為550.34U/g組織濕重和344.20U/g組織濕重。

圖5　不同濃度下4種水果總SOD活力比較Fig.5　Com parison of T-SOD ability of four common fruit in differentconcentration

圖6 4種水果總SOD活力比較Fig.6　Comparison of T-SOD ability of four common fruit

2.4抗氧化協(xié)同作用分析

2.4.14種水果間抑制羥自由基協(xié)同作用分析

4種水果抑制羥自由基協(xié)同作用比較見圖7。

圖7　4種水果抑制羥自由基協(xié)同作用比較Fig.7　Com parison of the synergistic effectofhydroxyl radical inh ibiting ability of four comm on fruit

從圖7中可以看出，根據(jù)作用效果，葡萄與西柚可聚為一類，這2種水果分別與其他3種水果進(jìn)行兩兩組合后，其抑制羥自由基的能力比單一存在情況下高，且表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用（P＜0.05），說(shuō)明這2種水果分別與其他3種水果合用后在清除羥自由基上有一定的正協(xié)同作用；對(duì)于葡萄而言，其抑制羥自由基能力的順序?yàn)槠咸?西柚＞葡萄-蘆柑＞葡萄-檸檬＞葡萄，且西柚對(duì)其的協(xié)同作用最為明顯。對(duì)于西柚而言，其抑制自由基能力的順序?yàn)槲麒?檸檬＞西柚-蘆柑＞西柚-葡萄＞西柚，且檸檬對(duì)其的協(xié)同作用效果最高。

檸檬與蘆柑可聚為一類，這2種水果分別與其他3種水果進(jìn)行兩兩組合后，既有正協(xié)同作用又有負(fù)協(xié)同作用。對(duì)于檸檬，其抑制羥自由基能力的順序?yàn)闄幟?西柚＞檸檬-葡萄＞檸檬＞檸檬-蘆柑，檸檬與西柚及葡萄進(jìn)行組合后抑制羥自由基的能力比單一成分抑制羥自由基的能力高，呈現(xiàn)正協(xié)同；而檸檬與蘆柑組合后，組合物質(zhì)抑制羥自由基的能力反而低于單一成分抑制羥自由基的能力，呈現(xiàn)負(fù)協(xié)同。對(duì)于蘆柑，其抑制自由基能力的順序?yàn)樘J柑-西柚＞蘆柑-葡萄＞蘆柑＞蘆柑-檸檬，蘆柑與西柚、葡萄組合后，抑制羥自由基的能力呈現(xiàn)正協(xié)同；而蘆柑與檸檬組合后，呈現(xiàn)負(fù)協(xié)同。

從圖7中可以知道，西柚-檸檬2種配合使用抑制羥自由基的能力在所有組合使用的水果組合中是最強(qiáng)的，兩兩組合后正協(xié)同作用抑制能力的順序?yàn)槲麒?檸檬＞西柚-蘆柑＞西柚-葡萄＞葡萄-蘆柑＞檸檬-葡萄。

2.4.24種水果間抑制超氧陰離子自由基協(xié)同作用分析

4種水果抑制超氧陰離子協(xié)同作用比較見圖8。

圖8　4種水果抑制超氧陰離子協(xié)同作用比較Fig.8　Com parison of thesynergistic effectof superoxideanion inhibiting ability of four common fruit

從圖8中可以看出，每種水果與其他水果進(jìn)行兩兩組合后，其抑制超氧陰離子的能力比單一存在情況下高。但根據(jù)作用效果的顯著性，葡萄、檸檬、蘆柑可聚為一類，這3種水果分別與其他水果兩兩組合后的協(xié)同增效作用顯著（P＜0.05）。葡萄其抑制超氧陰離子能力的順序?yàn)槠咸?檸檬＞葡萄-蘆柑＞葡萄-西柚＞葡萄，檸檬對(duì)葡萄的正協(xié)同作用最為明顯。檸檬其抑制超氧陰離子能力的順序?yàn)闄幟?西柚＞檸檬-蘆柑＞檸檬-葡萄＞檸檬，西柚對(duì)檸檬的正協(xié)同作用最為有效。蘆柑其抑制超氧陰離子能力的順序?yàn)樘J柑-檸檬＞蘆柑-葡萄＞蘆柑-西柚＞蘆柑，檸檬對(duì)蘆柑的正協(xié)同作用最為明顯。而根據(jù)作用效果的顯著性，西柚單獨(dú)為一類，西柚其抑制超氧陰離子能力的順序?yàn)槲麒?檸檬＞西柚-蘆柑＞西柚-葡萄＞西柚，檸檬對(duì)西柚的正協(xié)同作用最高，但兩兩組合之間的協(xié)同增效作用不顯著。在所有兩兩組合中，檸檬-西柚的組合抑制超氧陰離子的效果最好。

2.4.34種水果間SOD活力協(xié)同作用分析

4種水果SOD活力協(xié)同作用比較見圖9。

圖9 4種水果SOD活力協(xié)同作用比較Fig.9　Com parison of the synergistic effectof SOD ability of four comm on fruit

通過(guò)圖9可以看出每種水果與其他水果進(jìn)行兩兩組合后，其SOD活力均比單一存在情況下高。但根據(jù)作用效果的顯著性，葡萄與西柚聚為一類。葡萄與西柚組合后，其兩兩增效作用非常不顯著。葡萄分別與檸檬及蘆柑進(jìn)行兩兩組合的增效作用顯著（P＜0.05），西柚分別與檸檬及蘆柑進(jìn)行兩兩組合的增效作用同樣顯著（P＜0.05）。而檸檬與蘆柑聚為一類，這2種水果分別與其他3種水果兩兩組合均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用（P＜0.05）。蘆柑與葡萄組合在所有兩兩組合的水果中，其對(duì)SOD的增效是最為明顯的。

3　討論

研究表明，4種常見水果對(duì)自由基均具有清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，其抑制自由基的能力與濃度成正相關(guān)，其中檸檬對(duì)羥自由基及超氧陰離子的抑制能力最高，其SOD活力也最高。在抗氧化協(xié)同作用上，4種水果兩兩組合除在抑制羥自由基能力上出現(xiàn)個(gè)別負(fù)協(xié)同現(xiàn)象，在抑制超氧陰離子和增加SOD活力上均為正協(xié)同作用，且協(xié)同增效作用較為明顯。協(xié)同增效作用的出現(xiàn)可能是2種抗氧化物質(zhì)復(fù)合使用時(shí)，除了按本身特性發(fā)揮抗氧化清除自由基作用外，還與另一水果在相互復(fù)合配伍過(guò)程中相互作用，相互影響，從而提高了相互間清除自由基的能力，也可能是產(chǎn)生了新的抗氧化物質(zhì)，同時(shí)也可能是抗氧化物質(zhì)濃度升高，使其抑制自由基的能力增大，從而使其抑制自由基的能力得以增強(qiáng)。但檸檬和蘆柑兩者進(jìn)行組合后在抑制羥自由基上出現(xiàn)負(fù)協(xié)同作用，可能是因?yàn)?種組合使用后，其抑制羥自由基的有效物質(zhì)相互作用產(chǎn)生抵消或稀釋作用而使其抑制羥自由基的能力下降。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，清除自由基協(xié)同作用還與抗氧化物質(zhì)本身的性質(zhì)、清除自由基的能力，及反應(yīng)濃度有關(guān)。要對(duì)協(xié)同抗氧化作用有更加深入的了解還需要更進(jìn)一步研究。

人們?nèi)粘Ｉ钪校谶x購(gòu)及使用水果時(shí)，可以將檸檬-西柚，蘆柑-葡萄兩兩組合使用，提高自由基的清除率，提高抗氧化效果。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.006

收稿日期：2014-05-20

基金項(xiàng)目：泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校四種常見水果的抗氧化性研究（2012XJ02）

作者簡(jiǎn)介：陳琳琳（1984—），女（漢），講師，碩士，主要從事藥物分析及分析檢測(cè)方面的研究。

Com parison of Four Common Fruit Synergistic Free Radical Scavenging Capacity

CHEN Lin-lin，XIEZhi-xin，XURong，GUOYou-hong
（QuanzhouMedicalCollege，Quanzhou 362000，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：The free radical scavenging ability of four common fruit（grapes，grapefruit，lemon，citrus）were measured and compared by spectrophotometric method，and combination of free radical scavenging ability synergieswerestudied.The resultsshowed that free radicalscavenging ability of lemonwasbest.Thesynergistic effectofhydroxyl radicalscavenging was individually in addition to thephenomenon ofnegative；thesynergistic effectofsuperoxideanion and SODwerepositive，and theeffectswereobvious.

Keywords：fruit；radical；synergistic effect