RCE－4結(jié)構(gòu)改造及其抗腫瘤活性的研究

盧小豐 尉小琴 劉呈雄 黃年玉 鄒 坤

（三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

甾體皂苷是自然界中分布很廣的一種天然有機化合物，具有廣泛的生理活性.關(guān)于甾體皂苷藥理活性涉及了很多方面，如對血液系統(tǒng)的作用、抗真菌、抗炎和抗腫瘤等［1－2］.例如：蒺藜用于治療高血壓、眼病、腹脹、皮癬和氣管炎［3］，Dracaena draco被用于抗腹瀉和止血［4］，Chlorophytum malayense對腫瘤有潛在的細(xì) 胞毒活性［5］，Takashi Ohtsuki等［6］從 Calamus insignis中提取了5種甾體皂苷，并發(fā)現(xiàn)他們都具有抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂的作用.甾體皂苷的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，但苷元母核一般為螺甾烷型或呋甾烷型，呋甾烷型苷元在酶水解的條件下可轉(zhuǎn)化為螺甾烷型苷元.同樣，螺甾烷型苷元在一定的酸水解條件下也可以轉(zhuǎn)化為呋甾烷型苷元［7］.甾體皂苷的糖基主要以D－葡萄糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、D－木糖、L－阿拉伯糖為主，最近也有關(guān)于甾體皂苷含芹糖的報道［8］.本實驗室在前期研究過程中，從吉祥草根莖中獲得一個含量大且具有很好的細(xì)胞毒活性的甾體皂苷RCE－4，即25 （S）－5β－spirostan－1β，3β－diol1－O－α－L－rhamnopyranosyl－（1→2）－β－D－xylopyranoside（如圖1所示）.

圖1 RCE－4

RCE－4體外對Caski腫瘤細(xì)胞株具有較好的細(xì)胞毒活性，IC50為3.71μM.在此基礎(chǔ)上，對RCE－4進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，通過水解得到皂苷元.在皂苷上進(jìn)行氯代，得到1－單氯代和1，3－雙氯代兩個產(chǎn)物.在皂苷元上進(jìn)行氧化，得到1－位氧化產(chǎn)物和1，3－位雙氧化產(chǎn)物兩個產(chǎn)物.利用核磁、質(zhì)譜、紅外等方法對所有化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，并利用經(jīng)典的MTT方法，對目標(biāo)化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性的檢測.初步探討了其構(gòu)效關(guān)系，對以后的實驗設(shè)計指明了方向，為同類化合物的結(jié)構(gòu)修飾提供了支持.合成路線如圖2所示.

圖2 合成路線圖

1 實驗部分

1.1 主要實驗儀器及材料

1H－NMR，13C－NMR 用 Bruker Ultra－shied TM 400MHz核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)；紅外用Perkin－Elemer PE－983紅外光譜儀測定；MS用Finnigan Trace質(zhì)譜儀測定；熔點用北京第三光學(xué)儀器廠生產(chǎn)的X4熔點儀測定，溫度未經(jīng)矯正；所有試劑均為分析純級別，有機溶劑均為分析純試劑，從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司購買；實驗室所需實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 25（S）－5β－螺甾烷－1β，3β－二醇（a）的合成

稱取RCE－4（710mg，1mmol）于反應(yīng)瓶中，加入1mol／L鹽酸（1，4－dioxane：H2O＝1∶1）50mL，70℃攪拌3h.50mL氯仿萃取3次，合并有機相，無水Na2SO4干燥，濃縮得到黃色固體，柱層析分離（乙酸乙酯／石油醚＝1∶5）得到化合物a，白色固體，收率：293.3mg（68%）；熔點295～297℃，IR（KBr，cm－1）：3280，2950，2886，1463，1094，1056，985.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.36－4.42（m，1H），4.17（s，1H），3.93－3.96（m，1H），3.84（s，1H），3.28－3.32（d，J＝11.2Hz，1H），3.03（s，2H），1.25－2.06（m，25H），1.12（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝7.2Hz，3H），0.76（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ109.7，80.8，73.8，68.4，65.1，62.1，56.2，42.1，41.9，40.4，40.2，39.7，35.5，33.7，32.1，31.7，30.4，27.0，26.1，26.0，25.9，25.7，20.7，18.8，16.4，16.0，14.2.MS（ESI）m／z431.1［M－H］－.

1.3 25（S）－5β－螺甾烷－1α－氯－3β－羥基（b）和25（S）－5β－螺甾烷－1α，3α－二氯（c）的合成

稱取化合物a（432mg，1mmol）于反應(yīng)瓶中，60 mL氯仿作為溶劑，加入二氯亞砜0.5mL，催化量吡啶，常溫攪拌1.5h.水洗，氯仿萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，濃縮得到黃色固體，柱層析分離（乙酸乙酯／石油醚＝1∶8）得到化合物b，白色固體，收率：184.8mg（51%），熔點196～198℃.IR（KBr，cm－1）：2952，2927，2876，1449，1187，1051，921.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.91（s，1H），4.67（d，J＝3.6Hz，1H），4.37－4.42（m，1H），3.93－3.96（m，1H），3.29（d，J＝10.8Hz，1H），2.55－2.60（m，1H），2，34－2.38（m，1H），1.09－2.03（m，26H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝6.8Hz，3H），0.77（s，3H）；13C－NMR（CDCl3，400 MHz）：δ109.7，83.9，80.6，76.8，65.1，62.0，56.0，42.1，41.3，40.2，39.9，39.7，35.0，32.1，32.0，31.7，27.0，26.7，25.9，25.7，25.4，24.6，20.6，18.3，16.3，16.0，14.2.MS（ESI）m／z 451.8［M＋H］＋.

柱層析分離（乙酸乙酯／石油醚＝1∶12）得到化合物c，白色固體，收率：173.4mg（41%），熔點：258～261℃.IR（KBr，cm－1）：2927，2876，1449，1187，1051，921.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.71（s，1H），4.46（d，J＝4.0Hz，1H），4.37－4.43（m，1H），3.92－3.96（m，1H），3.59－3.63（m，1H），3.29（d，J＝9.6Hz，1H），1.24－2.09（m，25H），1.16（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝6.8Hz，3H），0.77（s，3H）；13C－NMR（CDCl3，400MHz）：δ109.7，80.6，79.8，72.8，65.1，62.1，56.0，42.1，41.2，40.2，40.1，39.9，35.0，32.6，32.4，31.7，27.0，26.7，25.9，25.7，25.5，22.5，20.6，18.3，16.3，16.0，14.2.MS（ESI）m／z 467.3［M＋H］＋.

1.4 25（S）－5β－螺甾烷－1－羰基－3β－羥基（d）和25（S）－5β－螺甾烷－1，3－二酮（e）的合成

稱取化合物a（432mg，1mmol）于反應(yīng)瓶中，30 mL氯仿作為溶劑，加入新制PCC（645mg，3mmol），常溫攪拌4h.抽濾，水洗，CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，濃縮得到黃色固體，柱層析分離（乙酸乙酯／石油醚＝1∶6）得到化合物d，白色固體，收率：116.7mg（27%），熔點247～249℃.IR（KBr，cm－1）：3370，2924，2861，1696，1377，1057，985.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.48（s，1H），4.38－4.44（m，1H），3.91－3.96（m，1H），3.30（d，J＝10.8Hz，1H），2.75－2.79（m，1H），1.18－2.36（m，25H），1.17（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.97（d，J＝6.8Hz，3H），0.75（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ214.1，109.7，80.7，69.3，65.1，62.0，56.2，52.8，45.5，42.9，42.0，40.7，39.8，38.0，35.0，32.9，31.5，29.6，27.0，26.4，25.9，25.7，22.6，16.3，16.0，15.3，14.2.MS（ESI）m／z453.0［M＋Na］＋.

柱層析分離（乙酸乙酯／石油醚＝1∶10）得到化合物e，黃色固體，收率：192.1mg（44%），熔點250～253℃.IR（KBr，cm－1）：2940，2865，1161，1546，1453，1224，1184，1065，987.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.39－4.43（m，1H），3.92－3.96（m，1H），3.58－3.63（t，J＝6.8Hz，1H），3.24－3.31（m，2H），3.04－3.11（m，1H），2.32－2.38（m，1H），1.16－2.09（m，25H），1.08（d，J＝7.2Hz，3H），0.97（d，J＝4.0Hz，3H），0.75（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ207.2，203.2，109.7，80.6，65.1，61.9，56.4，56.0，52.0，42.7，42.5，42.1，40.7，39.7，37.1，34.8，31.4，27.0，25.9，25.7，25.4，25.2，22.8，16.4，16.0，15.8，14.2.MS（ESI）m／z427.1［M－H］－.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成方法討論

RCE－4是由苷元和一個二糖連接的化合物，在確定其具有良好的抗腫瘤活性后，致力于研究和探討苷元母體對其本身抗腫瘤活性的影響，所以計劃水解掉糖鏈，繼而在其母體上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾.利用1mol／L的HCl溶液在70℃攪拌3h，即可將糖鏈水解除掉，得到RCE－4苷元.

得到的苷元在1－位和3－位分別具有一個羥基，計劃在羥基上對次結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定改造.利用SOCl2再加入弱的親核試劑吡啶，反應(yīng)可產(chǎn)生氯負(fù)離子，可得到從反式進(jìn)攻羥基的產(chǎn)物，機理如圖3所示.

圖3 反應(yīng)機理

在實驗過程中，也進(jìn)行了縛酸劑的篩選，從較多縛酸劑中發(fā)現(xiàn)Et3N和吡啶的效果相對較好，產(chǎn)率相對較高，而吡啶又是其中產(chǎn)率最高的.Et3N可以充當(dāng)縛酸劑，但產(chǎn)率相對吡啶來說就要低些，但是吡啶毒性較大，所以在量相對較少，對產(chǎn)率要求不是很高的時候可以選擇Et3N來作為此反應(yīng)的縛酸劑.

接下來用PCC對苷元進(jìn)行了氧化，PCC是吡啶和CrO3在鹽酸溶液中的絡(luò)合鹽，具有中等強度的氧化性能，有制作簡單，處理方便等優(yōu)點，產(chǎn)率也較穩(wěn)定.但它是鉻鹽，污染在所難免.在實驗過程中嘗試了多種氧化劑，如dess－martini氧化劑、瓊斯氧化劑、DCC＋DMSO氧化等，其中dess－martini氧化劑也具有較好的效果，而且比起鉻鹽更加環(huán)保.根據(jù)產(chǎn)物生成時間和產(chǎn)率來判斷，dess－martini氧化劑也是一種氧化性能相對較弱的氧化劑.

RCE－4水解后得到的苷元在1－位和3－位有兩個羥基，但這兩個羥基的反應(yīng)活性有比較大的差別.在氯代過程中得到兩種產(chǎn)物：1－位氯代和1，3－位雙氯代.在氧化過程中也得到兩種產(chǎn)物：1－位氧化和1，3－位雙氧化.結(jié)合平常觀察和實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1－位羥基較3－位更加活波，反應(yīng)時首先發(fā)生.3－位則沒有那么容易發(fā)生反應(yīng)，只有在1－位反應(yīng)完全后3－位才進(jìn)行反應(yīng).據(jù)此，也可以通過改變反應(yīng)條件和調(diào)整反應(yīng)時間來控制產(chǎn)物的產(chǎn)生，反應(yīng)條件加劇或是延長時間則可以得到更多1，3－位雙反應(yīng)產(chǎn)物.

2.2 結(jié)構(gòu)表征討論

在1H－NMR中，RCE－4由于連有一個二糖，在高場低場都出現(xiàn)了較多子峰信號.水解后，低場眾多質(zhì)子峰信號消失，證明水解成功，得到RCE－4苷元.結(jié)合13C－NMR譜圖和二維譜中歸屬了各個質(zhì)子峰，δ4.36－4.42出現(xiàn)一個質(zhì)子峰信號為 H－16，δ3.93－3.96和δ3.28－3.32的兩個質(zhì)子峰對應(yīng)的是 Ha－26，Hb－26，δ4.17和δ3.84出現(xiàn)的兩個質(zhì)子峰信號為H－1和H－3，δ3.03出現(xiàn)兩個質(zhì)子峰信號較為扁平，結(jié)合其它譜圖可知，為1－位和3－位兩個羥基上的活波氫信號.δ0.75－2.06出現(xiàn)的眾多氫信號、兩個單峰甲基信號、兩個雙峰甲基信號，13C－NMR譜圖中顯示27個碳都表明苷元母體結(jié)構(gòu)存在無誤.氯代產(chǎn)物13CNMR譜圖顯示27個碳信號，δ0.77－2.55出現(xiàn)眾多質(zhì)子峰信號表明產(chǎn)物存在.H－16，Ha－26，Hb－26三個質(zhì)子峰信號幾乎不變，δ3.03的兩個活波氫信號消失.1－位單氯代的H－1和H－3質(zhì)子峰信號則出現(xiàn)在δ 4.91和δ4.67處，1，3－位雙氯代的 H－1和 H－3質(zhì)子峰信號則出現(xiàn)在δ4.71和δ4.46處.氧化產(chǎn)物在1HNMR，13C－NMR譜圖中也與以上情況類似.H－16，Ha－26，Hb－26三個質(zhì)子峰信號依然沒有太多變化，H－1和H－3出現(xiàn)在δ4.17和δ3.84的兩個氫信號消失，結(jié)合二維譜圖確定δ4.48處出現(xiàn)一個氫信號為H－3，13C－NMR中在δ214.1處出現(xiàn)一個碳信號證明1－位羥基氧化成功.對雙氧化產(chǎn)物來說，1H－NMR中H－1和 H－3 的 質(zhì) 子 峰 信 號 消 失，13C－NMR 中 在δ207.2和δ203.2出現(xiàn)兩個碳信號直接證明此為1，3－位雙氧化產(chǎn)物.

2.3 化合物的生物活性分析

利用經(jīng)典的MTT方法，對目標(biāo)化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性的檢測.培養(yǎng)的Caski細(xì)胞按1×105個／mL的密度種植于96孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，將化合物配制成6個濃度梯度（50、25、12.5、6.25、3.13、1.57μg／mL），加入到96孔培養(yǎng)板中，每個濃度梯度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)置空白孔（含細(xì)胞的培養(yǎng)液＋MTT＋DMSO）、陽性藥物孔（含細(xì)胞的培養(yǎng)液＋絲裂霉素＋MTT＋DMSO）及調(diào)零孔（培養(yǎng)液＋MTT＋DMSO）.繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72 h后，于每孔中加入20μL的 MTT試劑（5mg／mL）顯色，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液，于每孔中加入150μL的DMSO，震蕩搖勻10min，使結(jié)晶物充分溶解.酶標(biāo)儀490nm波長下測其OD值，并計算抑制率和IC50值.

表1 化合物對Caski細(xì)胞的IC50值

結(jié)果表明：RCE－4體外對Caski腫瘤細(xì)胞株具有較好的細(xì)胞毒活性，在水解掉糖鏈之后，IC50值變大，活性變差.在苷元進(jìn)行氯代和氧化后的產(chǎn)物活性與苷元本身接近，表明經(jīng)過改造后活性也并沒有好轉(zhuǎn).這些說明糖鏈對該化合物的活性具有較大影響，也為以后的結(jié)構(gòu)修飾指明方向：1）進(jìn)行1－位糖基的修飾，如用苷元連接單糖、二糖和多糖，研究不同糖鏈對化合物活性的影響.2）進(jìn)行3－位糖基修飾或是1，3－位都連接糖基，討論1，3－位連接相同糖基時對不同連接部位對化合物活性的影響.3）可以在1－位設(shè)計類似糖基的鏈狀化合物，模擬糖基，從而得到不同碳鏈對化合物活性的影響.

3 結(jié) 語

利用酸對RCE－4進(jìn)行了水解，得到了苷元，繼而在苷元上進(jìn)行了一部分的修飾.利用本文這幾種方法進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系相對較干凈，操作簡單，在不考慮污染和毒性的情況下，氯代利用吡啶做縛酸劑，氧化利用PCC可以得到較好的收率.在考慮污染和毒性的情況下，氯代可以選擇三乙胺做縛酸劑，氧化也可以用dess－martin氧化劑，污染小，產(chǎn)率也相對可觀.RCE－4體外對Caski腫瘤細(xì)胞株具有較好的細(xì)胞毒活性（IC50為3.71μM），水解掉糖鏈?zhǔn)蛊涫チ藦姷哪[瘤細(xì)胞毒性，但提示可以進(jìn)行1－位糖基和3－位糖基的修飾.

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