排石沖劑對大鼠草酸鈣結石生成的干預效果及其機制研究

曹秋實，巴元明，羅俊華，王潔鈺

尿路結石是臨床上的常見病、多發(fā)病，其患病率為1%～15%［1］。該病治療后易復發(fā)，10年復發(fā)率高達50%［2］，嚴重影響人們的身心健康?，F(xiàn)代醫(yī)學對于尿路結石的治療存在療效不確切、有不良反應等不足。近20多年來，微創(chuàng)外科技術在臨床應用較廣泛，但仍存在沖擊波及外科手術可能引起創(chuàng)傷性損傷及急性腎功能損傷等問題［3］。手術患者還將面臨結石被摘除或排出體外后，高達60% ～80%的復發(fā)率［4］。因此，積極尋求一種療效確切、安全的防治結石的新療法，是國內外醫(yī)學界一直關注的問題。

中醫(yī)治療尿路結石已有數(shù)千年的歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗，在結石的防治中具有獨特療效和優(yōu)勢。排石沖劑在傳統(tǒng)中醫(yī)辨證論治基礎上，辨病與辨證相結合，針對尿路結石的主要發(fā)病機制，組方選藥配制而成，在臨床30余年的應用中，取得了顯著療效［5］。為了探討排石沖劑防治腎結石的作用機制，本研究以1%乙二醇和2%氯化銨為成石劑建立大鼠草酸鈣腎結石模型，以枸櫞酸鉀為對照，觀察排石沖劑對草酸鈣結石大鼠體質量、尿草酸水平、生化指標及腎組織病理變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，48只，周齡8～9周，體質量80～100 g，實驗動物使用許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。

1.1.2 實驗藥物 排石沖劑由湖北省中醫(yī)院制劑中心提供。組成:金錢草30 g、海金沙15 g、雞內金15 g、王不留行子15 g、滑石15 g、生牡蠣10 g、冬葵子15 g、白芍15 g、甘草5 g、石韋20 g、川楝子15 g等。

1.1.3 實驗試劑 乙二醇、氯化銨、枸櫞酸鉀均為分析純。1%乙二醇 (批號20121206)、枸櫞酸鉀 (批號20120524)購自國藥集團化學試劑有限公司;2%氯化銨 (批號20120612)購自天津永大化學試劑有限公司;冷凍切片馮庫薩 (Von Kossa)鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立草酸鈣結石大鼠模型 參照參考文獻 ［6-8］建立草酸鈣結石大鼠模型，以1%乙二醇自由飲水和2%氯化銨溶液灌胃為成石劑，實驗周期為4周。

1.2.2 分組與給藥 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組12只。正常組:給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，2 ml/d;模型組:給予成石劑，2 ml/d;枸櫞酸鉀組:給予成石劑及25%枸櫞酸鉀溶液灌胃，2 ml/d;排石沖劑組:給予成石劑及排石沖劑配成1.2 g/ml的混懸液灌胃，2 ml/d。各組大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2.3 標本收集及檢測方法 各組實驗結束時，將大鼠置于代謝籠，收集24 h尿液并計量，加防腐劑 (甲苯，用量1.0～2.0 ml甲苯/100 ml尿液)，4℃保存?zhèn)溆?大鼠稱重后，10%水合氯醛按0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈血管采集血液標本，并置于臨床用非抗凝血標本管，靜置后，3 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，留取淡黃色上清液(血清)備用;取左腎置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，作常規(guī)切片 (厚度為2 μm)。全自動德國羅氏生化分析儀測定血尿中Ca2+、Mg2+、P3+水平及血清中BUN、Cr水平，高效液相色譜法測定尿草酸水平。

1.2.4 腎臟結晶沉淀及病理檢測 石蠟切片分別做HE染色和Von Kossa染色。每只大鼠選取5張切片，于每張切片腎皮質處隨機選擇5個視野，觀察草酸鈣結晶，以每個視野的平均值來表示該片的結晶，按形態(tài)分級評分法進行評分［9］:0分=無結晶;1分=有散在的結晶亮點;2分=廣泛的不成堆或局限結晶;3分=有成堆結晶散在不連接;4分=結晶成堆且互相連接;5分=廣泛成堆結晶，連接成片。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，結晶評分組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 排石沖劑對草酸鈣結石大鼠存活情況、體質量變化及尿量的影響 實驗過程中，各組大鼠均無死亡，模型組第4周時大鼠出現(xiàn)食欲減退，毛發(fā)不榮，飲水減少，尿量減少，精神倦怠，身體蜷縮。而枸櫞酸鉀組和排石沖劑組大鼠，尿量增加，精神狀況良好，飲食活動基本正常，排石沖劑組療效更為明顯。

4組大鼠體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。4組大鼠24 h尿量比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01);枸櫞酸鉀組和排石沖劑組均高于正常組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);枸櫞酸鉀組與排石沖劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 各組大鼠體質量及24 h尿量比較 (±s)Table 1 Comparison of weight and 24 h urine volume in each group of rats

表1 各組大鼠體質量及24 h尿量比較 (±s)Table 1 Comparison of weight and 24 h urine volume in each group of rats

注:與正常組比較*P＜0.05;與模型組比較△P＜0.05

組別 只數(shù) 體質量(g) 24 h尿量(ml)12 141 ±14 15.1 ±0.8模型組 12 129±21 14.3±8.2枸櫞酸鉀組 12 132±16 20.3±6.4＊△排石沖劑組 12 138±16 22.3±5.7＊△F正常組1.37 5.17 P值值0.26 ＜0.01

2.2 排石沖劑對草酸鈣結石大鼠血尿草酸及尿生化指標的影響 4組大鼠尿草酸及尿Ca2+、P3+、Mg2+水平比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01);4組大鼠尿草酸、Ca2+、P3+水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);模型組、枸櫞酸鉀組與排石沖劑組大鼠尿Mg2+水平均低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);枸櫞酸鉀組與排石沖劑組大鼠尿Mg2+水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);枸櫞酸鉀組大鼠尿Mg2+水平與排石沖劑組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表2)。

2.3 大鼠血清生化指標比較 4組大鼠血清Mg2+和P3+水平比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);4組大鼠血清BUN、Cr和Ca2+水平比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01);枸櫞酸鉀組與排石沖劑組BUN、Ca2+水平均高于正常組，均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);枸櫞酸鉀組與排石沖劑組BUN、Ca2+水平比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);4組大鼠Cr水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表3)。

2.4 排石沖劑對腎結石大鼠腎臟病理的影響 肉眼觀察腎臟標本:正常組腎臟表面色澤均勻，組織結構清晰，切面鮮紅色;模型組腎臟表面色澤暗淡，明顯腫脹，有突出并散在分布的顆粒物，切面中心發(fā)白;枸櫞酸鉀組腎臟表面色澤稍暗，有腫脹，切面中心發(fā)白;排石沖劑組腎臟表面顏色正常，切面中心顏色稍淡。

光學顯微鏡下觀察草酸鈣結晶，常規(guī)HE染色為透明淡黃色晶體，Von Kossa's染色中晶體呈黑褐色。正常組大鼠腎皮質、髓質無結晶形成，細胞排列整齊、規(guī)則、結構清晰，腎小管腔內無沉積物，上皮細胞無腫脹充血，腎乳頭、腎盂及腎盞清晰;造模組大鼠腎臟可見大量的草酸鈣結晶形成，以腎皮質內多見，結晶成堆分布相互連接，腎小管管腔擴張明顯。枸櫞酸鉀組大鼠腎臟亦可見較多草酸鈣結晶，散在分布，腎小管有不同程度的擴張;排石沖劑組大鼠腎臟少量草酸鈣結晶，零星散在分布，少數(shù)腎小管有不同程度的擴張 (見圖1)。

2.5 各組大鼠腎組織中結晶形成情況 4組間結晶評分比較，差異有統(tǒng)計學意義 (H=7.714，P=0.005);其中，枸櫞酸鉀組和排石沖劑組草酸鈣結晶評分高于正常組，低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);排石沖劑組低于枸櫞酸鉀組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見圖2)。

表2 各組大鼠尿草酸及尿生化指標比較 (±s)Table 2 Comparison of urinary oxalate and urinary parameters in each group of rats

表2 各組大鼠尿草酸及尿生化指標比較 (±s)Table 2 Comparison of urinary oxalate and urinary parameters in each group of rats

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與枸櫞酸鉀組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) 尿草酸(mmol/24 h) Ca2+(mmol/L) P3+(mmol/L) Mg2+(mmol/L)正常組 12 20.80 ±2.54 0.25 ±0.03 10.05 ±2.27 0.93 ±0.08模型組 12 79.84 ±5.87* 0.78 ±0.05* 25.67 ±1.74* 0.53 ±0.05*枸櫞酸鉀組 12 40.80±3.78＊△ 0.53±0.06＊△ 21.43±1.87＊△ 0.71±0.03＊△排石沖劑組 12 32.75±2.44＊△▲ 0.41±0.04＊△▲ 15.15±2.17＊△▲ 0.75±0.06＊△F＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 512.50 278.50 138.60 96.48 P值值

表3 各組大鼠血清生化指標比較 (±s)Table 3 Comparison of serum biochemical parameters in each group of rats

表3 各組大鼠血清生化指標比較 (±s)Table 3 Comparison of serum biochemical parameters in each group of rats

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與枸櫞酸鉀組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) Ca2+(mmol/L) Mg2+(mmol/L) P3+(mmol/L)2.97 ±0.12模型組 12 12.54 ±1.63* 52.24 ±10.03* 2.26 ±0.37* 1.03 ±0.32 3.27 ±0.28枸櫞酸鉀組 12 9.38 ±0.78＊△ 45.25± 1.32＊△ 1.84±0.32＊△ 1.35 ±0.76 3.12±0.15排石沖劑組 12 8.25 ±0.64＊△ 41.28± 1.43＊△▲ 1.78±0.35＊△ 1.65 ±0.67 3.08±0.13 F正常組 12 6.34 ±0.74 30.18 ± 1.83 1.68 ±0.35 1.45 ±0.78＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.15 0.34 76.73 37.97 6.46 1.84 1.59 P值值

圖1 光學顯微鏡觀察各組大鼠腎組織切片F(xiàn)igure 1 Morphological changes in kidney sections with HE and Von Kossa's staining

圖2 各組腎組織草酸鈣結晶評分Figure 2 Scores of the renal calcium oxalate crystallization

3 討論

尿路結石是最為常見的疾病之一。草酸鈣結石或含有草酸鈣成分的結石是尿路結石中最常見的結石種類，約占80%［10］，故在動物實驗研究中多以建立草酸鈣結石大鼠為模型。乙二醇法是建立草酸鈣結石動物模型的常用方法，也是新藥評審中規(guī)定選用的方法之一，其建立模型的原理是乙二醇作為草酸形成的前體攝入可增加草酸合成，促進草酸鈣形成;氯化銨可導致腎小管上皮損害［11-12］，有利于結晶的滯留和生長，可以縮短乙二醇造模的時間。前期參照相關文獻［13-15］，本研究比較了不同方法對大鼠草酸鈣結石生成的干預效果。中醫(yī)學認為尿路結石屬于“石淋”“砂淋”“腰痛”等范疇，其病機為濕熱蘊結下焦，腎與膀胱氣化不利，日久煎熬尿液為石，正如《丹溪心法》中“諸淋所發(fā)，皆腎虛而膀胱濕熱也。腎主水，水結則化為石，腎虛而膀胱氣化不行，為熱所乘，熱則成淋”。故治療當清熱利濕，排石通淋。排石沖劑是巴元明教授在辨病與辨證相結合的基礎上，根據(jù)尿路結石的發(fā)病特點，結合全國知名腎臟病老中醫(yī)邵朝弟教授臨床經(jīng)驗，研制開發(fā)出一種以清熱利濕活血法治療尿路結石的新型純中藥制劑。前期臨床試驗表明:排石沖劑治療尿路結石有顯著的療效，總有效率達86%，且能有效提高結石排出率，縮短結石排出時間，改善臨床癥狀及陽性體征［16］。盡管如此，排石沖劑對尿路結石的防治作用尚需進一步闡明。

在臨床上，尿路結石患者多出現(xiàn)尿中Ca2+、草酸鹽、無機磷等排出增加，且常伴有血清Ca2+、草酸鹽的增加［15］。研究表明，大鼠尿中Ca2+與草酸水平較高是泌尿系結石形成所需要的［17］。草酸鈣結晶大量沉積于腎小管中，結晶可導致腎組織發(fā)生損傷，出現(xiàn)腎充血水腫，大量炎性細胞浸潤，對腎小管的重吸收功能和腎小球濾過功能產(chǎn)生嚴重影響［18］。草酸不僅以草酸鈣結晶的形式參與結石的形成，而且高濃度的草酸、草酸鈣晶體會激活細胞內相關信號通路，誘導腎小管上皮細胞氧化應激及炎癥損傷，損傷的腎上皮細胞為結石晶體的黏附提供了條件，同時產(chǎn)生的細胞碎片促進草酸鈣結晶的核化和聚集。

對于草酸鈣結石治療的研究，現(xiàn)代醫(yī)學多采用RAS抑制劑［19-20］、抗氧化劑［21-22］等藥物干預草酸鈣結石的形成過程，從而達到治療草酸鈣結石的效果。中醫(yī)藥治療草酸鈣結石的研究，多采用單味中藥提取物，如五倍子鞣質［23］、金錢草黃酮提取物［9］、蘆根提取液［24］等干預草酸鈣結石的形成。本實驗采用純中藥制劑干預草酸鈣結石大鼠，觀察中藥復方治療草酸鈣結石大鼠的療效，從而探討中藥制劑排石沖劑對大鼠草酸鈣結石生成的干預效果及其機制。

本實驗的模型組大鼠尿草酸、Ca2+、P3+及血清Ca2+、P3+水平明顯高于正常組，且與腎組織病理切片觀察到的結果相一致，可見此方法制作草酸鈣結石大鼠模型是成功的。通過觀察大鼠一般情況、血尿生化指標及尿草酸水平，可以發(fā)現(xiàn):排石沖劑組及枸櫞酸鉀組大鼠血清BUN、Cr較模型組均降低，且排石沖劑組雖較正常組偏高但更接近正常，說明排石沖劑具有改善腎功能的作用;同時，排石沖劑組及枸櫞酸鉀組24 h尿草酸及血尿Ca2+、P3+水平較模型組減少，說明排石沖劑能通過降低血Ca2+、P3+和促進尿酸排泄起到防治結石的作用。大鼠腎組織病理切片結果顯示，排石沖劑組草酸鈣結晶數(shù)量明顯減少，草酸鈣結晶在腎臟的沉積面積明顯縮小，腎小管水腫明顯改善，說明其有一定的溶石、排石或促進結石排出的作用。

綜上所述，排石沖劑能增加大鼠尿量，降低血尿Ca2+、P3+水平和促進尿草酸排泄，同時能改善腎功能，減少腎組織中草酸鈣結晶，改善腎組織水腫，從而達到促進結石排出，保護腎臟結構，抑制結石形成的作用，表明排石沖劑對尿路結石具有防治作用，為排石沖劑治療尿路結石的臨床運用提供必要的實驗依據(jù)。而排石沖劑防治草酸鈣結石的功效與RAS的激活和抗氧化應激等是否存在關聯(lián)，還有待于進一步研究。

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