NGAL在腎小管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制探討

康文齡

NGAL在腎小管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制探討

康文齡

目的 探討中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）缺氧-復(fù)氧(H/R)損傷中的作用及機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)NRK-52E，構(gòu)建細(xì)胞H/R模型，將細(xì)胞分為4組：正常對照組、H/R組、H/R +pcDAN3.1空載組、H/R+pcDAN3.1-NGAL組。結(jié)果 H/R組細(xì)胞相比正常對照組，凋亡率顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞生長受受抑制（P＜0.05）。和H/R組進(jìn)行對比，可發(fā)現(xiàn)H/R+pcDAN3.1-NGAL組細(xì)胞凋亡率明顯降低，G1期細(xì)胞所占的比例明顯下降，S期細(xì)胞所占的比例明顯增多，整體細(xì)胞量出現(xiàn)顯著的增殖現(xiàn)象，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 NGAL可通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在H/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

NGAL；缺血/再灌注損傷；腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白是kjeldsen L等1993年在中性粒細(xì)胞特異性顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種25Kd的小分子分泌型蛋白[1]。眾多研究表明，急性腎損傷發(fā)生時(shí)，腎小管上皮分泌的NGAL顯著增加，可作為AKI早期診斷及預(yù)后預(yù)測重要標(biāo)志物[2]，但有關(guān)NGAL生物學(xué)功能尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腎小管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧(H/R)模型，探討NGAL在腎小管上皮細(xì)胞缺血/復(fù)氧損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 HEPA—CLASS100三氣組織培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)（美國ATCC公司），pcDNA3.1空載及pcDAN3.1-NGAL質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室制備；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國

Gibco公司），二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（北京索萊寶科技有限公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 從液氮罐中取出凍存的NRK-52E細(xì)胞，37℃的水浴迅速解凍后吸出細(xì)胞懸液，加入10倍體積采用含10%FBS的DMEM、100mg/mL鏈霉素和100mg/ mL青霉素的培養(yǎng)基混勻，1000r/min，離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌1次后將細(xì)胞懸液稀釋混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%的細(xì)胞時(shí)，加入無血清培養(yǎng)基同步化12h，進(jìn)行試驗(yàn)[3-4]。將培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞分4組：正常對照組；缺血/缺氧模型組（H/R組）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1空載組（H/R+pcDAN3.1空載組）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1-NGAL組（H/R+pcDAN3.1-NGAL組）。

1.3 pcDNA3.1-NGAL構(gòu)建及鑒定 提取出生1周內(nèi)的C57小鼠脾臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到NGAL cDNA，PCR擴(kuò)增純化，并與載體pcDNA3.1/HisA用Acc65I 和EcoR1進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中,在Amp平板上篩選培養(yǎng)，37℃過夜，次日挑取單個(gè)菌落的陽性克隆,在5mL含

AmpLB中培養(yǎng)，37℃搖床220rpm 振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGAL對腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，H/R組NRK-52E細(xì)胞凋亡率顯著增加，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與H/R組相比，H/R+pcDNA3.1-NGAL組細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖 MTT法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果表明，H/R刺激可抑制NRK-52E細(xì)胞生長，與正常對照組相比，H/R組細(xì)胞活化增殖明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，n=3），而與H/R組比較，H/R+pcDNA3.1-NGAL組細(xì)胞增殖率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05,n=3）。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，H/R組及H/R+pcDAN3.1空載組細(xì)胞G1期比例增加，S期細(xì)胞比例降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，n=3），說明H/R刺激下NRK-52E細(xì)胞增殖受到抑制。與H/R組比較，H/ R+pcDNA3.1-NGAL組則表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例顯著降低，而S及G2期細(xì)胞比例增加（P＜0.05，n=3）。見圖3。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與HR組比較,#P＜0.05

圖2 各組細(xì)胞增殖能力變化注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與H/R組比較,#P＜0.05

圖3 各組細(xì)胞周期變化注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與H/R組比較,#P＜0.05

3 討論

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)作為一種小分子分泌型蛋白，在成人骨髓、子宮、前列腺、唾液腺、胃、闌尾、結(jié)腸和氣管以及胎兒脾臟和肺組織中都有低水平表達(dá)[5]，而在炎癥時(shí)的中性粒細(xì)胞、多種上皮癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增高[6-7]。2006年Mishra J等觀察到缺血再灌注損傷后的小鼠腎臟和順鉑誘導(dǎo)的中毒性腎損害中，小鼠尿液中NGAL顯著增高[8]，引起人們對NGAL與腎臟損傷相關(guān)性的關(guān)注，多項(xiàng)研究報(bào)道顯示，NGAL作為抑制新的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，對AKI早期診斷及預(yù)后預(yù)測具有重大意義，有關(guān)NGAL的研究引起眾多學(xué)者們興趣。2011年Barasch研究小組在Nature Medcine[9]上報(bào)道AKI時(shí)尿中NGAL不是來自正常時(shí)也低表達(dá)NGAL的中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、呼吸道和腸道等上皮細(xì)胞，而主要來自損傷腎上皮。

從本次實(shí)驗(yàn)可知，與對照組相比較，H/R組中的NRK-52E細(xì)胞凋亡率明顯提高，G1期細(xì)胞所占的百分比也明顯增加，而S期細(xì)胞所占百分比卻明顯減小，這表明細(xì)胞增殖出現(xiàn)受阻的情況。與H/R組相比，H/R+pcDAN3.1-NGAL組細(xì)胞凋亡率明顯降低，G1期細(xì)胞所占的比例明顯下降，G2期細(xì)胞以及S期細(xì)胞所占的比例明顯增多，整體細(xì)胞量出現(xiàn)顯著的增值現(xiàn)象，這表明NGAL能夠有效抑制細(xì)胞凋亡，以此促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖，能夠起到保護(hù)腎小管內(nèi)的上皮細(xì)胞。

綜上所述，NGAL作為一種新發(fā)現(xiàn)的AKI早期診斷標(biāo)志物，一方面可通過促進(jìn)S期DNA合成促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕缺血/復(fù)氧刺激導(dǎo)致的細(xì)胞生長抑制，另一方面，NGAL可下調(diào)多種促細(xì)胞凋亡分子表達(dá)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase12，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少細(xì)胞凋亡。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.010

江西 338000 江西省新余市人民醫(yī)院 （康文齡）