蛇床子素延緩叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞衰老

姚瓔珈，孔亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生學(xué)院，2.藥理學(xué)教研室，遼寧大連116600）

蛇床子素延緩叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞衰老

姚瓔珈1，孔亮1，教亞男1，李少恒1，陶震宇1，閆宇輝1，楊靜嫻2

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生學(xué)院，2.藥理學(xué)教研室，遼寧大連116600）

目的通過建立神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）體外衰老模型，探討蛇床子素（Ost）延緩NSC衰老的作用，并探討其可能調(diào)控機(jī)制。方法體外培養(yǎng)NSC，在增殖培養(yǎng)基中傳代純化培養(yǎng)至第3代，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。利用叔丁基過氧化氫（t-BHP）50，100和150 μmol·L-1分別與NSC孵育1，2和3 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，確定t-BHP 100 μmol·L-1與NSC孵育2 h為制備細(xì)胞衰老模型的最佳條件。再加入Ost 50，100和150 μmol·L-1作用1，2和3 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，選擇Ost促進(jìn)細(xì)胞存活的最佳作用濃度和作用時間。實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對照組、衰老模型組（NSC與t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h）和模型+Ost組（NSC與t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h后，再與Ost 100 μmol·L-1作用2 h），用Ki67染色法檢測NSC細(xì)胞增殖能力，免疫組化法檢測NSC分化能力，衰老β-半乳糖苷酶（Sa-β-gal）法檢測衰老細(xì)胞百分率，RT-PCR法檢測p53，p21，p19和p16基因表達(dá)，Western蛋白印跡法檢測P16、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶D1（CDKD1）和磷酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（pRb）蛋白表達(dá)。結(jié)果Ost 100 μmol·L-1作用2 h可明顯促進(jìn)NSC存活（P＜0.01）。與細(xì)胞對照組相比，模型組NSC增殖能力明顯下降（P＜0.05），分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力亦明顯下降（P＜0.05），Sa-β-gal陽性衰老細(xì)胞百分率升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組NSC增殖能力升高（P＜0.05），分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力亦明顯提高（P＜0.05），Sa-β-gal陽性衰老細(xì)胞百分率下降（P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組p16和p53mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），p19和p21mRNA表達(dá)無顯著性變化；與模型組相比，模型+Ost 100 μmol·L-1組P16蛋白表達(dá)降低，同時CDKD1和pRb蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論Ost具有延緩t-BHP造成NSC衰老的作用，其延緩NSC衰老作用機(jī)制可能與調(diào)控P16-pRb信號通路有關(guān)。

神經(jīng)干細(xì)胞；蛇床子素；增殖；分化；衰老

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.006

細(xì)胞衰老的概念是由Hayflick和Moorhead在培養(yǎng)正常人成纖維細(xì)胞時提出的，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的生長停滯期［1］。人們對衰老機(jī)制的認(rèn)識存在許多假說，例如免疫功能退化學(xué)說、自由基學(xué)說和線粒體損傷學(xué)說等［2］。隨著研究的深入，干細(xì)胞衰老是迄今解釋機(jī)體衰老機(jī)制的最新學(xué)說，人們意識到干細(xì)胞并非為“長生不老”的細(xì)胞。干細(xì)胞衰老表現(xiàn)為增殖能力和分化能力下降、端粒酶活性增強(qiáng)、端?？s短以及與衰老相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)［3］。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells， NSC）的衰老表現(xiàn)為自我更新和多向分化能力衰退、對神經(jīng)保護(hù)作用下降以及p16INK4a等衰老基因的表達(dá)上調(diào)［4］等。

蛇床子素（osthole，Ost）為獨(dú)活活性單體成分，中藥獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸（Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan）的干燥根［5］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Ost具有治療肺炎［6］、改善腎缺血再灌注損傷［7］以及促進(jìn)新生大鼠成骨細(xì)胞增殖［8］等作用。本研究通過建立NSC衰老模型，研究Ost是否具有延緩NSC衰老作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

自然分娩48 h內(nèi)的乳小鼠（SPF級昆明種小鼠），體質(zhì)量2～3 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK（遼）2008-0002。Ost，中國食品藥品檢定研究院。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶（0.25%）和雙抗（100 kU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素），美國Gibco公司；cAMP、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），美國Peptide公司；Trizol試劑、B27添加劑（B27）和引物序列，美國Invitrogen公司；p16：（上）ATGATGGGCAACGTTCACGTA；（下）AACGCAAATATCGCACGATGT；p19：（上）TCCAAGATGCCTCCGGTACT；（下）CCTGTGGTGGAGATCAGATTCA；p21：（上）GGGACAAGAGGCCCAGTACTT；（下）TGCGCTTGGAGTGATAGAAATC；p53（上）GCCATGGCCATCTACAAGAAG；（下）GCCTCGGGTGGCTCATAAG；β肌動蛋白：（上）GGGAAATCGTGCGTGACAT；（下）TCAGGAGGAGCAATGATCTTG；DMSO，美國Sigma公司；CCK-8試劑盒，美國Dojindo公司；叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP），成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；大鼠抗巢蛋白（nestin）抗體和兔抗胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白（SRY-related HMG-box 2，SOX2）抗體，美國Millipore公司；FITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體和Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG抗體，美國Jackson公司；兔抗Ki67抗體、兔抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔抗少突膠質(zhì)細(xì)胞前體蛋白（oligodendrocyte 2，NG2）抗體、兔抗神經(jīng)元核（neuronal nuclei，NeuN）抗體、P16抗體、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶D1（cyclin-dependent kinases D1，CDKD1）抗體和磷酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（phosphorylation retinoblastoma protein，pRb）抗體，北京博奧森公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR引物擴(kuò)增試劑盒，美國Thermo公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence β-galactosidase，Sa-β-gal）染色試劑盒，碧云天公司；全蛋白提取試劑盒、Bradford法檢測蛋白濃度試劑盒和蛋白緩沖液上樣試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DEPC和Triton X-100試劑，美國Amresco公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA），北京索萊寶科技有限公司。24孔板培養(yǎng)板和EP管，美國Cyagen公司；倒置熒光生物顯微鏡，日本尼康公司；超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱（NU-4750E），美國Nuaire公司；紫外-可見光分光光度計（UV-5600）和酶標(biāo)儀（MR-96A），深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；PCR儀（MG96G），杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀（4100），上海天能科技有限公司；水平核酸電泳儀（PowerPac系列），美國Bio-Rad公司。

1.2 NSC培養(yǎng)和鑒定

將自然分娩48 h內(nèi)的小鼠浸泡在75%乙醇中10 min，將其固定在手術(shù)臺上，取出海馬區(qū)，用含雙抗的PBS液清洗，收集于EP管內(nèi)，用手術(shù)剪將其剪碎，434.7×g離心8 min。棄上清，加入胰酶，37℃消化15 min，加入培養(yǎng)基終止消化，434.7×g離心8 min。棄上清，加入增殖完全培養(yǎng)基（DMEM/ F12+2%B27+0.2 μg·L-1EGF+0.2 μg·L-1bFGF+ 1%雙抗），混懸細(xì)胞，434.7×g離心7 min。棄上清，加入增殖培養(yǎng)基，以1×109L-1的密度接種于24孔板，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［9］。培養(yǎng)3～4 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)純化至第3代NSC接種于96孔板，培養(yǎng)至第3天用于實(shí)驗(yàn)。

以5×108L-1密度接種于96孔板，24 h后觀察細(xì)胞貼壁，用于鑒定。向96孔板每孔加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，加入1%Triton X-100透化，PBS清洗3次，加入1%BSA稀釋的巢蛋白抗體和SOX2抗體（1∶150），4℃孵育過夜。次晨用PBS清洗細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記羊抗大鼠IgG和Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG二抗（1∶100），室溫孵育1 h，再用DAPI染核15 min，PBS清洗后吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)的液體，滴加少量抗熒光淬滅劑，在倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況，觀察巢蛋白、SOX2和DAPI陽性細(xì)胞，重復(fù)拍照3次。

1.3 NSC衰老模型的制備［10］

第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h，將t-BHP溶于完全培養(yǎng)基，t-BHP終濃度分別為50，100和150 μmol·L-1，分別培養(yǎng)1，2和3 h。根據(jù)CCK-8試劑盒的說明書，每孔加入10 μL CCK-8溶液后放入培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值（A），每組3復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

1.4 CCK-8法檢測NSC存活率

選擇t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h制備NSC衰老模型，隨后再加入Ost 50，100和150 μmol·L-1作用1，2和3 h，細(xì)胞密度同1.3，用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，選擇Ost對NSC存活有促進(jìn)作用的最佳濃度和作用時間。

1.5 Sa-β-gal法檢測NSC衰老陽性率

第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，先用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h（同時設(shè)正常對照組和t-BHP模型組），然后每孔加入β-gal固定液100 μL，室溫15 min后用PBS清洗，每孔再加入100 μL染色工作液37℃孵育過夜，第2天吸出液體置于載玻片上觀察染色情況，觀察到部分NSC被染成藍(lán)色。每組設(shè)3復(fù)孔。在光鏡下計數(shù)NSC，再計數(shù)藍(lán)色NSC，藍(lán)色NSC數(shù)量占NSC總數(shù)百分比表示NSC衰老陽性率［11］。

1.6 免疫熒光染色法檢測NSC增殖和分化能力

根據(jù)1.5分組的細(xì)胞，第3代NSC以5×109L-1密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h，洗去原培養(yǎng)液，換成不含t-BHP和Ost的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，第3天觀察NSC的神經(jīng)球成球率。將NSC用兔抗Ki67一抗孵育過夜，再用Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG二抗孵育后，用DAPI染核15 min，計數(shù)Ki67染色陽性NSC百分率，檢測NSC增殖能力［12］。

將第3代細(xì)胞接種于分化培養(yǎng)基中（DMEM/F12+ 10%FBS+cAMP 100 mg·L-1+1%雙抗）［13］，用t-BHP100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h后洗去培養(yǎng)液，換成分化培養(yǎng)基再繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，觀察各組NSC分化為不同類型的神經(jīng)細(xì)胞。NSC分別用兔抗GFAP一抗、兔抗NG2一抗和兔抗NeuN一抗孵育過夜，再分別用Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG二抗孵育1 h，DAPI染核15 min。GFAP陽性細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞，NG2陽性細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞，NeuN陽性細(xì)胞為神經(jīng)元。

1.7 RT-PCR檢測p53，p21，p19和p16基因的表達(dá)

取1.5分組并處理的細(xì)胞，將培養(yǎng)的神經(jīng)球打散為單個NSC，培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，棄去培養(yǎng)液，提取細(xì)胞總RNA［14］。根據(jù)試劑盒的說明書合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，p16，p19，p21，p53和β肌動蛋白退火溫度分別為61.9，65.3，64.4，65.8和53.3℃，30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后延伸10 min。利用ImageJ圖像分析軟件對條帶進(jìn)行積分吸光度（integrated absorbance,IA）掃描，用待測基因與β肌動蛋白條帶IA比值表示待測基因相對表達(dá)水平。

1.8 Western蛋白印跡法檢測P16，CDKD1和pRb蛋白表達(dá)

取1.5分組并處理的細(xì)胞，每組1×107細(xì)胞，根據(jù)全蛋白試劑盒說明書提取蛋白，用Bradford法檢測蛋白質(zhì)濃度，配制SDS-PAGE凝膠，每孔加蛋白100 ng，80 V穩(wěn)壓電泳。在樣品過濃縮膠后，調(diào)整為100 V，當(dāng)指示劑達(dá)到分離膠底部停止電泳，然后用預(yù)飽和的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜用TBST液清洗后，用1∶1000稀釋的抗P16，CDKD1,pRb和β肌動蛋白一抗孵育，4℃過夜，次晨用1∶2000稀釋的二抗37℃孵育1 h，用DAB試劑盒顯色，用ImageJ圖像分析軟件對條帶進(jìn)行IA掃描，用待測蛋白與β肌動蛋白條帶IA比值表示待測蛋白相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSC培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)至第3天細(xì)胞完全形成NSC球并逐漸增大，第5天形成由大量單個細(xì)胞組成近圓形的NSC球（圖1A）。巢蛋白免疫熒光染色單個NSC核為綠色（圖1B），SOX2為紅色（圖1C），巢蛋白和SOX2重復(fù)（merge）結(jié)果（圖1D和E）顯示，通過機(jī)械分離培養(yǎng)的NSC球同時顯示巢蛋白和SOX2陽性特征。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，巢蛋白特異性標(biāo)志NSC陽性細(xì)胞數(shù)占DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核陽性細(xì)胞數(shù)的比例＞95%，表明培養(yǎng)純化至第3代的細(xì)胞基本為NSC。

Fig.1 ldentification of neural stem cells（NSCs）from rat hippocampus by immunofluorescent staining.A：Typical neurosphere on the 5th day（×400）；B：nestin stained NSCs（×400）；C：SRY-related HMG-box 2（SOX2）stained NSCs（×400）；D：nestin/SOX2merge photo（×400）；E：nestin/SOX2merge photo（×200）.

2.2 NSC衰老模型的制備條件

CCK-8法檢測結(jié)果（圖2）表明，t-BHP 50 μmol·L-1作用1～3 h對NSC存活無明顯抑制作用；150 μmol·L-1作用2和3 h，＞60%細(xì)胞死亡；t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h NSC存活率為（61.3± 3.6）%。因此，選擇t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h制備NSC衰老模型。

Fig.2 Survival rate of NSCs with tert-butyl hydroperoxide（t-BHP）treatment.compared with t-BHP 1 h group at the same concentration.

2.3 蛇床子素對衰老NSC存活率的影響

由圖3可見，t-BHP 100 μmol·L-1作用1～3 h, NSC存活率均明顯低于正常對照組（P＜0.01）；Ost 100和150 μmol·L-1作用2 h對t-BHP導(dǎo)致的NSC存活率下降有改善作用（P＜0.01，P＜0.05）。Ost其他濃度和其他作用時間無明顯作用。

Fig.3 Effect of osthole（Ost）on NSC survival after treatment with t-BHP.compared with normal control group on the same time；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with t-BHP group on the same time.

2.4 蛇床子素對NSC衰老率的影響

由圖4所示，與正常對照組相比，模型組Sa-βgal染色陽性細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，Ost 100 μmol·L-1作用2 h Sa-β-gal染色陽性細(xì)胞百分率下降30.0%（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of Ost on percent of senescence β-galactosidase（Sa-β-gal）stainingpositiveNSCsafter treatment with t-BHP（×200）.NSCs were incubated with t-BHP 100 μmol·L-1for 2 h，then incubated with Ost 100 μmol·L-1for another 2 h.A：normal control；B：t-BHP group；C：t-BHP+Ost group.The arrow shows senescenced NSCs.D was the quantitative result of A-C.n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with t-BHP group.

2.5 蛇床子素對NSC增殖和分化的影響

由圖5所示，與正常對照組相比，模型組ki67陽性NSC百分率明顯降低（P＜0.01），Ost組ki67陽性率與模型組相比增加了43.9%，表明Ost可逆轉(zhuǎn)t-BHP導(dǎo)致的NSC增殖能力的降低。

Fig.5 Effect of Ost on proliferation of NSCs after treatment with t-BHP（×200）.See Fig.4 for the cell treatment.A:normal control group;B:t-BHP model group;C:t-BHP+ Ost group;1:Ki67 staining cells(red);2:DAPI staining cells (blue);3:Ki67+/DAPI+merge diagram.D was the quantitative result of A-C.compared with normal control group;##P＜0.01,compared with t-BHP group.

由圖6所示，與正常對照組相比，NSC分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）、神經(jīng)元（NeuN，紅色）和少突膠質(zhì)細(xì)胞（NG2，紅色）NSC百分率明顯降低（P＜0.05,P＜0.01）；與模型組相比，Ost組NSC分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的百分率分別提高了29.4%和17.8%，但分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的百分率無顯著性變化。

2.6 蛇床子素對P53-P21-PRb與P16-PRb通路上的p53，p21，p19和p16mRNA表達(dá)的影響

由圖7所示，與正常對照組相比，模型組p16，p19，p21和p53mRNA的表達(dá)明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，Ost組p16和p53mRNA的表達(dá)分別降低至44.7%和38.5%（P＜0.05），但p21和p19mRNA的表達(dá)無顯著性差異，提示Ost可能對NSC的P16-pRb信號通路有影響。

2.7 蛇床子素對NSCP16-pRb通路上的P16，CDKD1和pRb蛋白表達(dá)的影響

Fig.6 Effect of Ost on differentiation ability of NSCs after treatment with t-BHP（×200）.See Fig.4 for the cell treatment.A:normal control group;B:t-BHP model group;C: t-BHP+Ost group;1:GFAP+（red）/DAPI+(blue)merge diagram; 2:NeuN+（red）/DAPI+（blue）merge diagram;3:NG2+（red）/ DAPI+(blue)merge diagram.D was the quantitative result ofcompared with normal control group;#P＜0.05,compared with t-BHP group.

Fig.7 Effect of Ost on p53，p21，p19 and p16 mRNA expression of NSCs after treatment with t-BHP by RT-PCR. See Fig.4 for the cell treatment.Lane 1：normal control group；lane 2：t-BHP model group；lane 3：t-BHP+Ost group.B was the semiquantitative result of A.compared with normal control group；#P＜0.05，compared with t-BHP group.

由圖8所示，與正常對照組相比，模型組P16蛋白表達(dá)升高了49.1%，CDKD1和pRb蛋白表達(dá)分別下降了48.8%和35.1%（P＜0.05，P＜0.01）；Ost組與模型組相比，P16蛋白表達(dá)降低了20.7%，CDKD1和pRb蛋白表達(dá)提高了16.9%和16.6%（P＜0.01），進(jìn)一步表明Ost延緩NSC衰老的作用機(jī)制可能是與P16-pRb通路有關(guān)。

Fig.8 Effect of Ost on protein expression of P16, cyclin-dependent kinases D1(CDKD1）and phosphorylation retinoblastoma protein(pRb）in NSCs after treatment with t-BHP by Western blotting.See Fig.4 for the cell treatment.Lane 1:normal control group;lane 2:t-BHP model group;lane 3:t-BHP+Ost group.B was the semiquantitative result of A.compared with normal control group;#P＜0.05,compared with t-BHP group.

3 討論

NSC是一種具有自我更新、多向分化的細(xì)胞，t-BHP為一種過氧化物，它可通過氧化應(yīng)激途徑造成細(xì)胞的增殖能力、分化能力下降而衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，t-BHP造模后，NSC的增殖和分化能力均明顯下降，符合NSC衰老特征。Ost 100 μmol·L-1作用2 h后，與衰老模型組相比，可明顯提高NCS存活率；通過免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn)，Ki67陽性率增加了43.9%，向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化能力提高了29.4%和17.8%，向少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞分化不明顯。另外，Ost作用后，可降低與衰老相關(guān)的β-gal陽性率。上述結(jié)果表明，Ost可改善衰老NSC的增殖和分化能力，并降低衰老細(xì)胞的百分率，對NSC具有延緩衰老的作用。

P53-P21-pRb和P16-pRb信號途徑是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的兩條途徑。p16基因是由Serrano等［15］利用酵母雙雜交蛋白互相作用掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個陽性cDNA克隆蛋白，此蛋白對CDK4活性具有抑制作用，所以將其稱為P16INK4a。pRb為人成視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老狀態(tài)，P16使CDKD1活性下降，進(jìn)而會抑制pRb的磷酸化，使其處在低磷酸化狀態(tài)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，NSC用t-BHP 100 μmol·L-1作用2 h，再用Ost 100 μmol·L-1作用2 h，可明顯降低p16mRNA的表達(dá)，p21和p19 mRNA表達(dá)與模型組相比無顯著性差異。提示Ost有可能通過作用于P16-pRb途徑發(fā)揮延緩NSC衰老的作用。Western蛋白印跡法結(jié)果表明，Ost可明顯降低NSC P16蛋白表達(dá)，增強(qiáng)CDKD1和pRb蛋白表達(dá)。說明，Ost對體外培養(yǎng)的NSC具有延緩衰老的作用，并且可能通過P16-pRb途徑發(fā)揮其作用。

大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病與氧化損傷引起的神經(jīng)元丟失有密切關(guān)系［17］，例如阿爾茨海默病，公認(rèn)的致病學(xué)說為神經(jīng)元的丟失，因?yàn)殡S著年齡的增加，NSC出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，增殖和分化能力均下降，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究通過Ost作用于衰老NSC，增強(qiáng)其增殖和分化能力，并且分化為更多神經(jīng)元，這將為治療有關(guān)神經(jīng)元丟失的疾病提供新的治療途徑。但從遺傳因素來看，衰老并非由單一基因所決定，而是由一套成熟的途徑中的各種靶點(diǎn)刺激下游基因發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)而引起的，本課題組正結(jié)合中藥多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，對發(fā)揮延緩NSC衰老的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

［1］Collado M，Blasco MA，Serrano M.Cellular senescence in cancer and aging［J］.Cell，2007，130（2）：223-233.

［2］Harman D.Free radical theory of aging：an update：increasing the functional life span［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1067：10-21.

［3］Limke TL，Rao MS.Neural stem cells in aging and disease［J］.J Cell Mol Med，2002，6（4）：475-496.

［4］Molofsky AV，Slutsky SG，Joseph NM，He S，Pardal R，Krishnamurthy J，et al.Increasing p16INK4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing［J］.Nature,2006，443（7110）：448-452.

［5］The People′s Republic of China Pharmacopeia in 2001(中華人民共和國藥典2010年版一部)［S］. Beijing：ChemicalEngineeringIndustryPress：2010.

［6］Li Z，Ji H，Song X，Hu J，Han N，Chen N.Osthole attenuates the development of carrageenan-induced lung inflammation in rats［J］.Int Immunopharmacol，2014，20（1）：33-36.

［7］Zheng Y，Lu M，Ma L，Zhang S，Qiu M，Ma X.Osthole ameliorates renal ischemia-reperfusion injury by inhibitinginflammatoryresponse［J］.UrolInt，2013，91（3）：350-356.

［8］Li LH，Ding DF，Du GQ，Gong H，Wang HH，Zhan HS.Effect of osthole on proliferation of neonatal rat osteoblast and the relative mechanism research［J］.Chin J Orthop Traumatol（中國骨傷），2013，26（5）：419-422.

［9］Yang J，Yan Y，Ciric B，Yu S，Guan Y，Xu H，et al.Evaluation of bone marrow-and brain-derived neural stem cells in therapy of central nervous system autoimmunity［J］.Am J Pathol，2010，177（4）：1989-2001.

［10］Yao YJ，Hu Y，Li SH，Jiao YN，Kong L，Tao ZY，et al.Osthole promotes the proliferation of neural stem cellsin vitro［J］.Chin J Tissue Eng Res（中國組織工程研究）,2014,18（32）：5184-5189.

［11］ADong CM，Wang XL，Wang GM，Zhang WJ，Zhu L，Gao S，et al.Stress-induced cellular aging model with postnatal neural stem cells［J］.Cell Death Dis， 2014，5：e1116.

［12］Scholzen T，Gerdes J.The Ki-67 protein：from the known and the unknown［J］.J Cell Physiol，2000，182（3）：311-322.

［13］Yang J，Yan Y，Ciric B，Yu S，Guan Y，Xu H，et al.Evaluation of bone marrow-and brain-derived neural stem cells in therapy of central nervous system autoimmunity［J］.Am J Pathol，2010，177（4）：1989-2001.

［14］Tatsumi K，Okuda H，Makinodan M，Yamauchi T，Makinodan E，Matsuyoshi H，et al.Transient activation of Notch signaling in the injured adult brain［J］.J Chem Neuroanat，2010，39（1）：15-19.

［15］Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4［J］.Nature，1993，366（6456）：704-707.

［16］Molofsky AV，He S，Bydon M，Morrison SJ，Pardal R.Bmi-1 promotes neural stem cell selfrenewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16Ink4a and p19Arf senescence pathways［J］.Genes Dev，2005，19（12）：1432-1437.

［17］Li WZ，Li WP，Zhang W，Yin YY，Sun XX，Zhou SS，et al.Protective effect of extract ofAstragaluson learning and memory impairments and neurons′apoptosis induced by glucocorticoids in 12-month-old male mice［J］.Anat Rec（Hoboken），2011，294（6）：1003-1014.

Osthole delays neural stem cells senescence induced by tert-butylhydroperoxide

YAO Ying-jia1，KONG Liang1，JIAO Ya-nan1，LI Shao-heng1，TAO Zhen-yu1，YAN Yu-hui1，YANG Jing-xian2
（1.Graduate School,2.Department of Pharmacology,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

OBJECTlVETo investigate the effect of osthole（Ost）on retardation of neural stem cells（NSCs）senescence induced by tert-butyl hydroperoxide（t-BHP）and to study the related mechanismin vitro.METHODSNSCs were cultured until the 3rd generation in proliferation mediumin vitroand used for subsequent experiments.t-BHP 50，100 and 150 μmol·L-1was incubated with NSCs for 1，2 and 3 h，and the viability of NSCs was determined using CCK-8 assay.Then,Ost 50，100 and 150 μmol·L-1was added for 1，2 and 3 h to choose the suitable concentration of Ost used in the following experiments.The ability of proliferation of NSCs was tested by Ki67 staining and differentiation by immune staining.Assay for aging cells was measured by senescence β-galactosidas（Sa-β-gal）stainingkit.Then,the mRNA expression ofp53，p21，p19andp16gene was detected by RT-PCR，and the expression of P16，cyclinD1 and pRb proteins was detemined by Western blotting.RESULTSThe CCK-8 assay results showed the optimum condition of t-BHP for the NSCs aging model was 100 μmol·L-1for 2 h，and the survival rate with Ost treatment increased significantly（P＜0.01）.The Ki67 positive rate significantly decreased（P＜0.05），the ability of proliferation into astrocytes，neurons and oligodendrocytes also decreased（P＜0.05），but Sa-β-gal staining revealed that percentage of aging NSCs increased（P＜0.01）in model group compared with control group.The Ki67 positive rate significantly increased（P＜0.05），the ability of proliferation into astrocytes，neurons and oligodendrocytes also increased（P＜0.05）,and Sa-β-gal staining revealed the decreasing percentage of aging NSCs（P＜0.01）in Ost group compared with model group.The results of RT-PCR showed that the expression ofp16andp53mRNA levels decreased in Ost group compared with t-BHP group（P＜0.05）.The expression ofp19andp21mRNA was not significantly different between model group and Ost group. The results of Western boltting showed that the expression of P16 protein decreased，while cyclinD1 and pRb protein increased in Ost group，respectively，compared with modelgroup（P＜0.05）.CONCLUSIONOst may delay the aging of NSCs induced by t-BHP,which may be related to inhibition of the activation of P16-pRb signaling pathway.

neural stem cells；osthole；proliferation；differentiation；senescence

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173580）;National Natural Science Foundation of International Cooperation and Exchange Projects（81210108050）;and Liaoning Province Higher Talents to Support Projects（5 group,No.191）

YANG Jing-xian,E-mail:1980483684＠qq.com

R285.5

A

1000-3002（2015）04-0565-08

2014-12-04接受日期：2015-07-21）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金（81173580）；國家自然科學(xué)基金國際合作交流項(xiàng)目（81210108050）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃項(xiàng)目（5組191號）

姚瓔珈（1990-），女，碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

楊靜嫻，E-mail：1980483684＠qq.com