雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ELISA）方法測定卵類黏蛋白

李晶，王薇，張燕，陸旸，王碩，*（.天津出入境檢驗檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ELISA）方法測定卵類黏蛋白

李晶1，王薇2，張燕2，陸旸2，王碩2，*
（1.天津出入境檢驗檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；2.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

摘要：卵類黏蛋白是雞蛋中的主要過敏原，因此建立相應的檢測方法對保障消費者健康非常重要。為此本試驗分別制備了卵類黏蛋白特異性兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體，對不同檢測條件進行優(yōu)化，最終建立了一種用于定量分析卵類黏蛋白的雙抗夾心ELISA方法，并對檢測方法的精密度進行考察。結(jié)果表明，通過對封閉液、捕獲抗體包被量和檢測pH的優(yōu)化，該方法的最低檢出限達到（0.274±1.27）ng/mL，且具有良好的特異性以及檢測精密度。因此，所建立的方法可用于食品中卵類黏蛋白的定量檢測。

關(guān)鍵詞：過敏原；卵類黏蛋白；雙抗夾心ELISA方法

雞蛋是人們?nèi)粘Ｉ钪凶钇毡橐椎玫牡鞍踪|(zhì)來源之一。由于含有豐富的蛋白質(zhì)和卵磷脂、固醇類、蛋黃素以及多種礦物質(zhì)和維生素，雞蛋已經(jīng)成為嬰幼兒主要的膳食蛋白來源，被廣泛用于嬰幼兒餅干、米粉和面條中。卵類黏蛋白是雞蛋中的主要過敏原。據(jù)統(tǒng)計，在全世界上，大約有0.5%～2.5%的兒童對雞蛋過敏，其已經(jīng)成為僅次于牛奶的引發(fā)嬰幼兒食物過敏的食物[1-2]。卵類黏蛋白是蛋清中含量最高且致敏性最強的一種蛋白[3]。由于含有糖基組分，其穩(wěn)定性較高，在熱處理和胰蛋白酶降解下均相當穩(wěn)定[4]。因此，建立對其有效地檢測方法對保障消費者健康至關(guān)重要。

目前檢測致敏蛋白的方法主要包括免疫學檢測方法和PCR方法[5-9]。但是PCR方法往往存在操作繁雜和難以定量等問題。相比之下，基于免疫學方法的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)具有高效、靈敏和低成本等優(yōu)點。因此，本文利用此項技術(shù)建立并優(yōu)化了用于食品中卵類黏蛋白含量的雙抗夾心ELISA檢測方法，該方法具有較低的最低檢出限和較好的重現(xiàn)性，可用于相關(guān)部門的檢測。

1　材料與方法

1.1試劑和材料

卵類黏蛋白、弗氏完全佐劑、牛血清白蛋白（BSA）、弗氏不完全佐劑、羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標物、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（含量≥99.9%）、羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶標物、甘氨酸、BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過氧化氫脲（CH6N2O3）、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、脫脂乳粉、魚皮膠：Sigma公司；Tween 20：上海浦東化工試劑廠；丙三醇（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；變色硅膠：天津市化學試劑一廠；β-環(huán)糊精、二甲基亞砜（DMSO）：德國 Merck公司；Protein G-Sepharose、Protein A-Sepharose 4B：美國Amersham公司；96孔酶標板：美國Thermo公司。

1.2儀器設(shè)備

BioLosic LP蛋白純化儀：美國BIO-RAD公司；Mlultiskan Spectrum酶標儀：美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1卵類黏蛋白兔多克隆抗體的制備

以卵類黏蛋白為免疫原對新西蘭大耳白兔進行免疫，制備卵類黏蛋白特異性抗體。兩周免疫1次，共免疫5次，并采血清。采用間接ELISA法測定血清的效價。利用Protein A-Sepharose4B免疫親和層析柱對抗體進行純化。

1.3.2卵類黏蛋白鼠多克隆抗體的制備

試驗用BALB/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100μg/只。第4次免疫后取血并純化后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3卵類黏蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立

將卵類黏蛋白兔多抗包被于96孔聚苯乙烯酶標板中（100μL/孔），然后4℃下孵育12 h～16 h。PBST洗液洗板3次后，在酶標板中加入封閉液（200μL/孔），于37℃封閉1 h。之后用PBST洗液洗板3次，每孔加入卵類黏蛋白標準溶液，于37℃下孵育1 h，取出后用PBST洗液洗板3次。隨后，將卵類黏蛋白鼠多抗加入到酶標板中（100μL/孔），于37℃下孵育1 h，之后用PBST洗液洗板4次，然后將HRP標記的鼠二抗加入酶標板中（100μL/孔），37℃下孵育30min。PBST洗液洗板5次后，向每孔中加入底物A和B的混合液（100μL/孔），于37℃下顯色約15min～20min。然后加入終止液（50μL/孔）并利用酶標儀采用雙波長方式（450 nm～650 nm）讀取吸光度值（OD值）。

1.3.4雙抗夾心ELISA法選擇性的測定

雙抗夾心ELISA法選擇性的測定采用交叉反應程度進行測定。交叉反應程度采用交叉反應物吸光度值與陰性對照樣吸光度值的比值（P/N）進行表示。

2　結(jié)果與討論

2.1卵類黏蛋白雙抗夾心ELISA方法的建立

2.1.1封閉液的優(yōu)化

試驗分別采用0.5%魚皮膠、0.5%的脫脂乳粉、0.5%酪蛋白、1%明膠、1%的脫脂乳粉、1%BSA溶液、5%的脫脂乳粉作為封閉液，并對其空白值進行對比。不同封閉液的優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1　不同封閉液下空白的平均吸光度值Table1　Absorption valuesat the different blocking buffer

如表1所示，采用0.5%乳粉作為封閉液時的空白值最低，表明其非特異性吸附最小，因此本試驗選擇0.5%乳粉作為封閉液。

2.1.2捕獲抗體包被量的優(yōu)化

選擇0.075、0.1、0.15、0.2μg/孔作為兔多克隆抗體包被量，繪制檢測曲線圖，選擇曲線線性部分作圖，不同捕獲抗體包被量的優(yōu)化結(jié)果見圖1。

圖1　不同捕獲抗體包被量對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響Fig.1　Effectof captureantibody coating amounton OVM sandw ich ELISA

如圖1所示，當包被量為0.075μg/孔時，空白值最低，且最大吸光度值接在1.2左右。因此選擇兔抗卵類黏蛋白0.075μg/孔作為捕獲抗體的最終包被量。

2.1.3不同pH的優(yōu)化

本試驗選取pH為5.7、7.4、8.5的磷酸緩沖液進行試驗。不同pH對卵類黏蛋白空白值的影響見表2。

表2　不同pH對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的影響Table2　Effect of pH of PBSon sandw ich ELISA

如表2所示，當pH為7.4時，空白值最低，因此選擇pH 7.4，作為卵類黏蛋白雙抗體夾心ELISA法檢測的樣品稀釋液?？梢娺^酸或者過堿都會對待測蛋白的活性產(chǎn)生影響，這一結(jié)果與卵類黏蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)[10-11]。

2.1.4卵類黏蛋白雙抗夾心ELISA方法標準曲線的繪制

在上述優(yōu)化條件下，以兔多克隆抗體作為捕捉抗體（0.075μg/孔），鼠單克隆抗體作為檢測抗體，加入卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標準品，繪制黏蛋白間接競爭ELISA標準曲線（見圖2）。

圖2　卵類黏蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測的標準曲線（n=8）Fig.2　Standard curve ofOVM allergenson sandw ich ELISA （n=8）

如圖所示，所建立的雙抗夾心ELISA方法最低檢出限（LOD）值為（0.274±1.27）ng/mL（n=8）。

2.1.5卵類黏蛋白雙抗夾心ELISA方法的特異性

試驗選擇了11種常見食物過敏原（卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶總蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生總蛋白、大豆、杏仁和綠豆）進行檢測方法特異性測定。將這11種過敏原蛋白分別稀釋至10、1、0.1μg/mL，并以PBS作為陰性對照，計算交叉反應物吸光度值與陰性對照樣吸光度值的比值（P/N）。結(jié)果見表3，與11種食物的P/N值均小于2，表明交叉反應非常小，此本方法對卵類黏蛋白具有良好的的特異性。卵類黏蛋白的特異性試驗結(jié)果見表3。

2.2卵類黏蛋白雙抗夾心ELISA方法的精密度

本試驗選擇8個不同濃度的卵類黏蛋白溶液進行分析，分別考查板內(nèi)變異和板間變異，對建立的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法進行精密度測試。

表3　雙抗體夾心ELISA檢測方法對卵類黏蛋白的特異性Table3　Cross-reactivity ofsandw ich ELISA for OVM

2.2.1卵類黏蛋白雙抗夾心板內(nèi)變異

選擇8個不同濃度的卵類黏蛋白溶液進行分析，根據(jù)每一個濃度對應得到的吸光度值計算平均值以及標準偏差，得到變異系數(shù)。不同濃度的卵類黏蛋白溶液的板內(nèi)變異結(jié)果見表4。

表4　雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法板內(nèi)變異（n=4）Table4　Variance in-p late of sandw ich ELISA for OVM（n=4）

由表4可知吸光度值變異系數(shù)大部分在2.97%～13.14%之間，表明所建立的方法具有良好的板內(nèi)重復性。

2.2.2卵類黏蛋白雙抗夾心板間變異

在相同條件下，取空白和8個不同濃度的卵類黏蛋白溶液，進行分析，綜合5 d測得的吸光度值A(chǔ)450-650進行分析。不同濃度的卵類黏蛋白溶液的板間變異結(jié)果見表5。

表5　卵類黏蛋白雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法板間變異（n=5）Table5　Variance between-plateofsandw ich ELISA for OVM （n=5）

由表5可知吸光度值變異系數(shù)均在8.24%～14.70%之間，因此本方法具有良好的板間重復性。

3　結(jié)論

本試驗建立并優(yōu)化了一種用于檢測卵類黏蛋白的雙抗夾心ELISA方法，選用0.5%乳粉作為封閉液，優(yōu)化后的捕獲抗體包被量為0.075μg/孔，檢測pH為7.4。該方法的最低檢出限可達到（0.274±1.27）ng/mL，且具有良好的板間和板內(nèi)重現(xiàn)性，因此所建立的方法可用于對卵類黏蛋白的定量檢測。

參考文獻：

[1]羅嘉瑩,黃惠敏,鄭佩燕,等.廣東省學齡前兒童食物過敏情況及相關(guān)危險因素分析[J].重慶醫(yī)科大學學報,2013,38(8):843-847

[2]胡燕.重視開展兒童食物過敏研究[J].中國兒童保健雜志,2011, 19(6):489-491

[3]Lemon-Mule H,Sampson H A.Immunologic changes in children with egg allergy ingesting extensively heated egg[J].Journal of Allergyand Clinical Immunology,2008,122(5):977-983

[4]Walsh B J,Hill D J,Macoun P.et al.Detection of four distinct groupsofhen eggallergensbingding IgE in the seraof childrenwith eggallergy[J].Allergol Immunopathol(Madr),2005,33(4):183-191

[5]Monaci L,ViscontiIA.Immunochemical and DNA-based methods in food allergen analysis and quality assurance perspectives[J]. Trends in Food Science and Technology,2010,21(6):1-12

[6]余清,黃紅霞,劉紹文.食品過敏原及其檢測分析技術(shù)[J].質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究,2009(2):27-31

[7]HeiWenjing,Li Zhen,Ma X.Determination of beta-conglycinin in soybean and soybean productsusinga sandwich enzyme-linked immunosorbentassay[J]．Analytica Chimica Acta.2012(734):62-68

[8]吳序櫟,吉坤美,李佳娜,等.雙抗體夾心ELISA法測定食物中蝦過敏原成分[J].食品科技,2009,34(8):240-243

[9]詹政科,劉萍,吉坤美,等.雙抗體夾心ELISA法測定食物中牛奶過敏原蛋白成分[J].中國乳品工業(yè),2009,34(8):44-47

[10]Wolf Walter J,Sathe Shridhar K.Ultracentrifugal and polyacrylamide gel Electrophoretic studies of extractability and stability of almondmealproteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998(78):511-521

[11]NowakWegrzyn-A,Bloom KA,Sicherer SH,etal.Tolerance to extensively heatedmilk in children with cow’smilk allergy[J].Journal of Allergyand Clinical Immunology,2008,122(2):342-347

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.032

收稿日期：2015-08-27

基金項目：質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201310067）

作者簡介：李晶（1976—），女（滿），研究員，博士，生物技術(shù)與食品工程專業(yè)。

*通信作者

The Development of Sandw ich Enzyme-linked Immunosorbent Assay（ELISA）for Detecting Ovomucoid

LIJing1，WANGWei2，ZHANG Yan2，LU Yang2，WANGShuo2，*
（1.Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of Industrial ProductSafety TechnicalCenter，Tianjin 300308，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety Ministryof Education ofChina，The Schoolof Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University of Scienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Ovomucoid isamajorallergen in eggs，so it is important to develop a detectionmethod for it.In this study，anti-ovomucoid polyclonal antibodies and anti-ovomucoid monoclonal antibodieswere generated from rabbits and mice respectively.A sandwich ELISA for ovomucoid was developed and validated.Under the optimized conditions，the limit of detection was（0.274±1.27）ng/mL，with good selectivity and accuracy.The developed assaywassuitable forquantity ovomucoid in food samples.

Keywords：allergen；ovomucoid；sandwich ELISA