番石榴葉總黃酮提取物的體外生物學活性研究

李丹如，盧穎，田冰潔，吳曉英（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

番石榴葉總黃酮提取物的體外生物學活性研究

李丹如，盧穎，田冰潔，吳曉英*
（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

摘要：比較經(jīng)優(yōu)化條件提取的番石榴葉總黃酮粗提物（樣品A）和經(jīng)AB-8大孔樹脂純化的番石榴葉總黃酮精提物（樣品B）的體外生物學活性。通過清除DPPH自由基、羥自由基、還原力檢測樣品的抗氧化能力及研究對α-葡萄糖苷酶的抑制作用來比較樣品A、B的體外生物學活性。樣品A和樣品B的黃酮含量分別為7.8%、13.28%，對DPPH自由基的清除率分別為87.61%、97.22%，對羥自由基的清除率分別為62.32%、80.45%，樣品B的還原力遠大于樣品A；樣品A和樣品B對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為99.17%、99.81%，遠大于阿卡波糖。樣品A和樣品B都有一定的抗氧化能力和對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，總體上樣品B高于樣品A，可能與其中的總黃酮含量有關。

關鍵詞：番石榴葉；總黃酮；抗氧化；α-葡萄糖苷酶

番石榴是我國民間久用的一種植物藥，屬桃金娘科番石榴屬常綠多年生的灌木植物，原產(chǎn)于美洲，現(xiàn)在廣東省各地都有栽培[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為番石榴葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒、抗菌和抑制α-葡萄糖苷酶的作用等[3-4]。

在人體內(nèi)，當有極強氧化力的自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用時，將會使多種大分子物質(zhì)如核酸，蛋白質(zhì)等發(fā)生變性、DNA交聯(lián)斷裂等，從而導致細胞的結構變化和功能破壞，而從引起衰老、癌癥及心血管等退變性疾病[5]。

糖尿病是一種以高血脂為特征的全身性疾病，已成為威脅人類的第3位“健康殺手”。糖尿病分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，后者占絕大部分[6]。現(xiàn)今市面上的治療Ⅱ型糖尿病的藥物根據(jù)治療機制不同主要分為[7]：1）促胰島素分泌劑：如磺酰脲類；2）胰島素增敏劑：如屈吉他宗等噻唑烷衍生物；3）α-葡萄糖苷酶抑制劑：如阿卡波糖等。α-葡萄糖苷酶能使碳水化合物在小腸內(nèi)的消化過程延長，從而單糖在腸黏膜的吸收減緩，使餐后的血糖升高幅度降低，從而有效的預防和治療這類疾病。

黃酮類化合物具有很強的抗氧化作用[8-9]和α-葡萄糖苷酶的抑制作用[10]，近年來對黃酮抗氧化作用和對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究備受關注[11]。本試驗測定番石榴葉總黃酮的體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為番石榴葉總黃酮的藥理活性研究及天然食品抗氧化劑開發(fā)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

番石榴干葉：江門市江海區(qū)南粵金石榴茶制品廠。

1.1.2試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、無水乙醇、抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、鹽酸、α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、無水磷酸二氫鉀、三水磷酸氫二鉀、阿卡波糖，所用試劑均為分析純。

1.1.3儀器

WFZUV-2802SH型紫外可見分光光度計：廣州北銳精密儀器有限公司；PB-10型PH計：Sartorius；DT5-2臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；酶標儀：上海閃譜生物科技有限公司；BPG-9240A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HH-S型水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1番石榴葉總黃酮樣品的制備[12]

番石榴葉總黃酮粗提物（樣品A）的制備：總黃酮提取條件為：40%乙醇；料液比1∶20；提取3次；每次1 h。收集合并提取液，4 000 r/min離心10min后，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，用蒸餾水稀釋至200mL，用石油醚分3次萃取，每次100mL，收集下層液體烘干，即得番石榴葉總黃酮粗提物，記為樣品A。精密取樣品A配成1mg/mL的樣品溶液，利用差示分光光度法測定樣品A中總黃酮含量。

AB-8大孔樹脂純化：把樣品A配成6mg/m L的初始液，以1.0mL/min的流速上柱，再以體積分數(shù)為30%乙醇洗脫，洗脫體積約6BV。將30%乙醇洗脫液烘干后記為樣品B為番石榴葉總黃酮精提物。利用差示分光光度法測定樣品B中總黃酮含量。

1.2.2清除DPPH自由基能力測定[13]

取1mL樣品溶液及9mL 60μmol/L的DPPH無水乙醇于多個試管中，搖勻，避光反應30min后，在最大吸收波長517 nm處測定吸光值，計算DPPH自由基的清除率，根據(jù)公式1計算清除率，以VC作為對照品，各個試驗組需要重復3次，求其平均值。

式中：A0為1m L樣品溶劑+9m LDPPH溶液的吸光值；Ai為1m L不同濃度的樣品溶液+9m LDPPH溶液的吸光值；Aj為1mL不同濃度的樣品溶液+9mL無水乙醇的吸光值。

1.2.3清除羥自由基能力測定[14]

9mL反應液中含9mmol/LFeSO40.2mL，9mmol/L水楊酸0.5mL，以及不同濃度的樣品溶液1mL，最后加入0.3mL 8.8mmol/LH2O2啟動反應。37℃溫浴0.5 h后，4 000 r/min離心6min后，取其上清液測定510 nm處的吸光值。吸光值越低，清除·OH的效果越好。根據(jù)公式2計算·OH的清除率。

式中：Ai為某濃度樣品的吸光值，Ai0為不加H2O2時樣品溶液的本底值，A0為對照，不加樣品溶液。VC為陽性對照。

1.2.4還原力的測定[15]

將VC，樣品A，樣品B分別配置成不同濃度的樣品溶液，取樣品溶液1mL，加入1mL 0.2mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液和1mL 1%的鐵氰化鉀 [K3Fe（CN）6] 于10mL的試管中，搖勻，50℃水浴20min后加入1mL10%三氯乙酸溶液，500 r/min離心10min，取上清液2mL，加入1mL 0.1%氯化鐵溶液，充分混勻，10min后在700 nm下測吸光值。

1.2.5α-葡萄糖苷酶抑制試驗[16]

酶活力標準曲線的制作：用磷酸緩沖液（pH 6.8）配制1 000μmol/L PNP，稀釋成0、5、25、50、100、150、200、300、400μmol/L。分別取7種不同濃度的PNP溶液各160μL，加入0.2mol/LNa2CO3溶液80μL，混勻，在405 nm下測定吸光值，測3組取平均值。以吸光值為縱坐標，對硝基苯酚濃度為橫坐標，做出標準曲線。

取112μL磷酸鉀緩沖液（pH6.8），加入0.2U/mL α-葡萄糖苷酶20μL，8μLDMSO，37℃恒溫15min后加入2.5mmol/L的PNPG 20μL，37℃恒溫反應15min。再加入80μL濃度為0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波長下測吸光值。以阿卡波糖為陽性對照。

抑制百分率/%=（抑制劑活力/酶活力）×100（3）

式中：a為對照組（緩沖液+酶液+底物）的抑制百分率；b為空白組對照組（緩沖液）的抑制百分率；c為樣品測定組（樣品+酶液+底物）的對照百分率；d為樣品對照組（樣品+緩沖液）的對照百分率。

2　結果與分析

2.1不同番石榴葉總黃酮提取物的總黃酮含量的比較

利用差示分光光度法測得樣品A，樣品B中的總黃酮含量分別為7.8%，13.28%。純化前樣品A的黃酮含量為7.8%。純化后黃酮含量比純化前提高了70.26%。2.2樣品清除DPPH自由基能力的比較

不同樣品的DPPH清除率見圖1。

圖1　不同樣品的DPPH清除率Fig.1　DPPH scavenging rateof the different sam p le

從圖1可知，VC、樣品A、樣品B在低濃度的條件下對DPPH就有較強的清除力，當達到一定濃度范圍時，清除率變化不大。VC的最高清除率為96.76%，樣品A為87.61%，樣品B為97.22%?？傮w來說樣品B 對DPPH自由基的清除率要略高于樣品A。

2.3樣品清除羥自由基能力的比較

不同樣品的羥自由基清除率見圖2。

圖2　不同樣品的羥自由基清除率Fig.2　Hydroxyl radicalscavenging rate thedifferentsam ple

由圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，VC、樣品A、樣品B對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而不斷升高，其中VC濃度達到1mg/mL時，清除率達到97.35%；樣品A在濃度達到0.8mg/mL后，清除率變化不大，達62.32%；而樣品B的清除率一直處于逐漸升高的趨勢，最高達80.45%?？傮w上樣品B的羥自由基清除率高于樣品A。

2.4樣品還原力的比較

不同樣品的還原力件圖3。

圖3　不同樣品的還原力Fig.3　Reducing power of thedifferent sam ple

從圖3中可知，在相同濃度下，各樣品的還原力大小順序為：VC＞樣品B＞樣品A。其中樣品B與VC接近，并遠大于樣品A。

2.5樣品對α-葡萄糖苷酶抑制能力的比較

對硝基苯酚標準曲線如圖4。

圖4　對硝基苯酚光密度標準曲線Fig.4　Opticaldensity curve of PNP

對硝基苯酚濃度和吸光值的標準曲線回歸方程是：y=0.007 9x+0.046 4（R2=0.999 6），對硝基苯酚溶液濃度在0～350μmol/L范圍內(nèi)線性關系良好。

阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的影響見圖5，樣品對α-葡萄糖苷酶的影響見圖6。

圖5　阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的影響Fig.5　Them ass concentration of Acarbose effect on inhib itory activity ofα-glucosidase

圖6　樣品對α-葡萄糖苷酶的影響Fig.6　Them ass concentration of samp leeffects on inhibitory activity ofα-glucosidase

由圖5可以看出，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性呈劑量依賴性，抑制率最高達到52.79%。

由圖6可知隨著樣品A，樣品B濃度的增加，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸增強，有明顯的濃度-效應關系，當樣品濃度小于0.7mg/mL時，樣品A、樣品B對α-葡萄糖苷酶的抑制作用相近，當樣品濃度高于0.7mg/m L時，樣品B對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到99.81%，樣品A為99.17%。兩種樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用要遠高于阿卡波糖。

3　結論

經(jīng)優(yōu)化條件提取的番石榴葉總黃酮粗提物（樣品A）和經(jīng)AB-8大孔樹脂純化的番石榴葉總黃酮精提物（樣品B）都有較好的抗氧化能力和抑制α-葡萄糖苷酶的活性。樣品A和樣品B的黃酮含量分別為7.8%、13.28%，對DPPH自由基的清除率分別為87.61%、97.22%，對羥自由基的清除率分別為62.32%、80.45%，樣品B的還原力遠大于樣品A；樣品A和樣品B對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為99.17%、99.81%，遠大于阿卡波糖。研究數(shù)據(jù)表明，樣品B的活性要高于樣品A，且樣品B的總黃酮含量要高于樣品A，說明番石榴葉提取物的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶的活性與總黃酮含量有關。在兩種樣品黃酮含量都較低的情況下，仍具有較高的生物學活性，也就是說番石榴葉中的黃酮物質(zhì)具有較高的生物學活性，本研究為番石榴的進一步開發(fā)利用提高供了理論參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.006

收稿日期：2014-05-29

作者簡介：李丹如（1993—），女（漢），本科，研究方向：天然物提取與分析。

*通信作者：吳曉英（1961—），女（漢），副教授，研究方向：生物制藥。

Study on Vitro Bioactivity of Guava Leaves Flavonoids

LIDan-ru，LUYing，TIANBing-jie，WUXiao-ying*
（Collegeof Bioscience and Bioengineering，South China UniversityofTechnology，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：Compared the vitro bioactivity of guava leaves flavonoids crude extract by the optimal extraction conditions（sample A）and guava leaf flavonoids fine extract purified by AB-8macroporous resin（samp le B）. Studied on antioxidation of samples by the DPPH radical scavenging，hydroxyl radical scavenging，reducing powerandα-glucosidase inhibitory to comapre thevitrobioactivity between sample A and sample B.Flavonoids content of the sample A and sample B were 7.8%and 13.28%，with DPPH free radical scavenging rates of 87.61%and 97.22%，with hydroxyl radical scavenging rate of 62.32%and 80.45%and withα-glucosidase inhibitory ratesof 99.17%and 99.81%，which aremuch larger than acarbose.And restoring force of sample B ismuch larger than the sample A.Sample A and samp le B has a certain amount of antioxidant activity andαglucosidase inhibitory effect，which may have a certain relationship with flavonoids，as a whole，sample B slightlyhigher than the sample.

Keywords：guava leaf；flavonoids；antioxidation；α-glucosidase