香蕉細(xì)菌性枯萎病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增快速檢測技術(shù)

王念武，陳勁松，沈建國，黃 振，翁瑞泉

(1.福清出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福清350300;2.泉州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 泉州362000;3.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州350002;4.福州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州350002)

香蕉細(xì)菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2，Rs2)是危害香蕉最嚴(yán)重的病原細(xì)菌，R. solanacearum 種以下有不同的race 型，根據(jù)寄主的不同而分為5 個(gè)races［1］，香蕉細(xì)菌性枯萎病菌則屬于其中的race 2。香蕉細(xì)菌性枯萎病菌主要侵害三倍體香蕉及赫蕉，可致使植株發(fā)生嚴(yán)重的枯萎，最終導(dǎo)致整株死亡［2，3］。香蕉細(xì)菌性枯萎病菌是我國禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物，在我國未見分布。我國雖然對進(jìn)境香蕉和香蕉種苗進(jìn)行檢疫，但對進(jìn)境芭蕉屬(Musa)和蝎尾蕉屬(Heliconia)的景觀類植物未進(jìn)行該細(xì)菌的檢測，而這些植物也可作為香蕉細(xì)菌性枯萎病菌寄主［4］，對攜帶并傳入該病菌存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

Nilsson et al［5］于1994年提出鎖式探針檢測技術(shù)。近年來，該技術(shù)以靈敏、特異、穩(wěn)定等特點(diǎn)，廣泛用于微生物鑒定、細(xì)胞原位檢測、醫(yī)學(xué)病原檢測等領(lǐng)域。該技術(shù)可以在恒溫下等溫?cái)U(kuò)增［6］，1 h 內(nèi)達(dá)到109個(gè)拷貝數(shù)［7］。本研究根據(jù)香蕉細(xì)菌性枯萎病菌獨(dú)有的插入序列ISRso19，設(shè)計(jì)特異性鎖式探針，采用超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)技術(shù)，對香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的檢測方法進(jìn)行研究，以期為口岸把關(guān)和疫情監(jiān)測提供新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香蕉細(xì)菌性枯萎病菌由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院趙文軍研究員提供;番茄細(xì)菌性潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis)、楊桃細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonas syringae pv. Averrhoii)、番茄青枯病菌(R.solanacearum race 1)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola)、番茄細(xì)菌性葉斑病菌(P. syringae pv. Tomato)、柑橘潰瘍病菌(X. citri)和西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.Citrulli)由福建農(nóng)林大學(xué)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA 連接酶(NEB 公司)，核酸外切酶Ⅰ(NEB 公司)，核酸外切酶Ⅲ(NEB 公司)，Bst DNA 聚合酶(NEB 公司)，2 ×PCR Master Mix(Tangen 公司)，Sterilized ddH2O(NEB 公司)，dNTPs(Promega 公司)，100bp DNA Ladder(Tangen 公司)，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN Bacterial DNA Kit)。PCR 儀(ABI 公司)，凝膠成像系統(tǒng)，核酸蛋白儀(瑞典AMERSHAM，型號ULTROSPEC1100)，電泳儀(瑞典AMERSHAM)，離心機(jī)(Eppendorf 公司)。

1.3 鎖式探針的設(shè)計(jì)

以Lee et al［8］獲得的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌插入序列IS Rso19 部分堿基序列(GenBank:AF450275)作為靶標(biāo)DNA 模板，按照王念武等［9］的方法設(shè)計(jì)Rs2 的鎖式探針。設(shè)計(jì)合成的鎖式探針及引物見表1。

表1 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 的鎖式探針和引物Table 1 Primers and padlock probe of HRCA for Rs2

1.4 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增

1.4.1 鎖式探針的環(huán)化連接 以提取的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌和其他參試菌株的DNA 為模板，分別與鎖式探針PLPrs2 進(jìn)行環(huán)化連接。10 μL 反應(yīng)體系為:DNA 模板2 μL，40 U·μL-1Taq DNA 連接酶0.15 μL，400 pmol·L-1探針0.2 μL，10 ×Taq DNA 連接酶緩沖液1 μL，無菌去離子水補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件為:94℃4 min;94 ℃35 s，65 ℃5 min，15 個(gè)循環(huán);95 ℃10 min 滅活剩余連接酶。反應(yīng)完成后，立即將產(chǎn)物冰浴5 min 用于之后試驗(yàn)，或置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 未環(huán)化鎖式探針的消化 預(yù)先制配10 μL 混合液?；旌弦簶?gòu)成為:5 U·μL-1核酸外切酶Ⅲ1 μL，10 ×核酸外切酶Ⅲ緩沖液2 μL，10 U·μL-1核酸外切酶Ⅰ1 μL，10 ×核酸外切酶Ⅰ緩沖液2 μL，無菌去離子水4 μL。向環(huán)化連接后的產(chǎn)物中加入該10 μL 預(yù)混液后，37 ℃水浴2.5 h 消化未環(huán)化的鎖式探針，再于90 ℃水浴15 min，滅活核酸外切酶。

1.4.3 HRCA 擴(kuò)增 用擴(kuò)增引物進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增。以鎖式探針連接環(huán)化、消化后的產(chǎn)物作為模板，反應(yīng)體系為25 μL(環(huán)化連接消化后產(chǎn)物2 μL，10 μmol·L-1padR 0.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μmol·L-1padF 0.5 μL，8 U·μL-1Bst DNA 聚合酶0.5 μL，10 ×Bst DNA 聚合酶緩沖液2.5 μL，滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL)。63 ℃恒溫條件下反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后每個(gè)樣取8 μL 進(jìn)行電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2.0%，最后經(jīng)染色、凝膠成像分析反應(yīng)結(jié)果。

1.5 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增的特異性

以供試的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌等9 種細(xì)菌的DNA 為模板，按照上述方法，分別與鎖式探針PLPrs2 進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增，測試香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增的特異性。

1.6 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增的靈敏度

香蕉細(xì)菌性枯萎病菌DNA 濃度經(jīng)測定后，進(jìn)行系列稀釋。之后各取2 μL 作為DNA 模板，按照上述方法，分別與鎖式探針PLPrs2 進(jìn)行超分支滾環(huán)擴(kuò)增，測試香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增的最低DNA 檢測濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增檢測技術(shù)的建立

在香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增試驗(yàn)中，分別優(yōu)化了線性探針的終濃度和擴(kuò)增的反應(yīng)溫度。結(jié)果表明，HRCA 擴(kuò)增的最適反應(yīng)溫度為63 ℃(圖1)，線性探針最佳終濃度為5 pmol·L-1(圖2);在消化反應(yīng)中，用6 U 核酸外切酶Ⅲ和10 U 核酸外切酶Ⅰ共同消化連接產(chǎn)物2.5 h，可以消除線性探針的干擾影響。優(yōu)化后的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、凝膠成像分析，呈典型的階梯狀條帶(圖3)。

圖1 不同溫度下的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HCRA 擴(kuò)增 Fig.1 HRCA under different temperature for Rs2

圖2 不同終濃度探針的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HCRA 擴(kuò)增Fig.2 HRCA under different final concentration of padlock probe for Rs2

2.2 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增的特異性

在供試的9 種細(xì)菌中，僅香蕉細(xì)菌性枯萎病菌出現(xiàn)階梯狀分布條帶，檢測結(jié)果為陽性;其余8 種細(xì)菌均未出現(xiàn)階梯狀分布條帶，結(jié)果為陰性(圖4A)。該結(jié)果表明，HRCA 擴(kuò)增檢測香蕉細(xì)菌性枯萎病菌具有特異性。另外，采用Lee et al［8］提供的引物對供試的9 種細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，僅香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的PCR 擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，其他則為陰性(圖4B)。比較HRCA 擴(kuò)增和PCR 擴(kuò)增結(jié)果，兩種方法擴(kuò)增結(jié)果一致，都具有特異性。因此，建立的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 技術(shù)對香蕉細(xì)菌性枯萎病菌有特異性，可以用于該菌快速檢測。

圖3 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 擴(kuò)增電泳圖Fig.3 The electrophorogram of HRCA for Rs2

2.3 HRCA 擴(kuò)增檢測香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的靈敏度

當(dāng)香蕉細(xì)菌性枯萎病菌DNA 濃度≥500 fg·μL-1時(shí)，結(jié)果為陽性;當(dāng)DNA 濃度＜500 fg·μL-1時(shí)，結(jié)果呈陰性(圖5)，最低DNA 檢測濃度為500 fg·μL-1。采用Lee et al［8］的PCR 方法，檢測香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的靈敏度，結(jié)果表明，最低DNA 濃度為5 pg·μL-1(圖5)。比較HRCA 方法和常規(guī)PCR 方法可以發(fā)現(xiàn)，HRCA 方法具有更高的靈敏度，高出常規(guī)PCR 擴(kuò)增方法一個(gè)數(shù)量級。

圖4 HRCA 法檢測香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的特異性Fig.4 Detected specificity by HRCA for Rs2

圖5 HRCA 法檢測香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的靈敏度Fig.5 Detected sensitivity by HRCA for Rs2

3 討論

細(xì)菌快速檢測方法各有優(yōu)勢和不足。血清學(xué)ELISA 方法靈敏度低，適用于細(xì)菌的初篩;常規(guī)PCR 方法和實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，有較高的靈敏度，但容易受模板DNA 的污染，而使結(jié)果出現(xiàn)誤判［10］。HRCA 擴(kuò)增技術(shù)只特異性地?cái)U(kuò)增鎖式探針，模板DNA 只起到讓線性鎖式探針環(huán)化的作用。因此，在HRCA 擴(kuò)增技術(shù)體系中，模板DNA 不會(huì)富集，避免了PCR 方法中靶標(biāo)DNA 富集的影響。

在細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測中，常利用細(xì)菌相對保守的16S rDNA 堿基序列來設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行細(xì)菌種類的檢測和鑒定。對于種間差別較大的細(xì)菌可以用該方法檢測和鑒定，但對于相似種或是種以下的不同race 型則很難，因?yàn)樗鼈兊?6S rDNA 堿基序列幾乎相同。香蕉細(xì)菌性枯萎病菌相似的race 型有5 種，因此本研究采用香蕉細(xì)菌性枯萎病菌獨(dú)有的插入序列ISRso19 部分堿基作為模板，用HRCA 擴(kuò)增技術(shù)對該菌進(jìn)行研究，實(shí)現(xiàn)了香蕉細(xì)菌性枯萎病菌HRCA 特異性擴(kuò)增，靈敏度可達(dá)500 fg·μL-1，高于常規(guī)PCR 一個(gè)數(shù)量級。

在基層口岸植物檢疫實(shí)驗(yàn)室，往往都存在著缺乏儀器設(shè)備的客觀情況，而基于鎖式探針的HRCA 擴(kuò)增技術(shù)對儀器設(shè)備要求不高，一般的口岸分支植物檢疫實(shí)驗(yàn)室都能具備，便于口岸應(yīng)用。另外，鎖式探針最大優(yōu)勢是高通量，可以與熒光PCR 技術(shù)、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)、DNA 芯片等技術(shù)結(jié)合［11，12］，尤其是結(jié)合DNA 芯片技術(shù)，可同步檢測多種病原微生物。在我國進(jìn)境的植物中，往往存在著多種病原微生物，利用基于鎖式探針的擴(kuò)增技術(shù)與DNA 芯片技術(shù)結(jié)合起來，可實(shí)現(xiàn)同種植物產(chǎn)品上多種病原有害生物的同步檢測，這對于提高口岸疫情把關(guān)，有效防止外來有害生物傳入，保護(hù)國內(nèi)農(nóng)林業(yè)和生態(tài)安全都具有重要意義。

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