植物中螯合肽物質(zhì)的研究方法綜述

張俊 潘易

（1麗水市環(huán)境監(jiān)測中心站 浙江麗水 323000 2麗水市固體廢物管理中心 浙江麗水 323000）

1 引言

通過與植物中一些對重金屬具有高親和力的大分子結(jié)合形成絡(luò)合物，可以使土壤中自由重金屬離子濃度下降，使得重金屬毒性降低。Grill等人在1985年分離純化得到鎘結(jié)合肽，正式命名為植物螯合肽[1]（Phytochelatin，即PC）。植物螯合肽是高等植物中分離得到最多的一種重金屬結(jié)合肽，是一種富含－SH的多肽，只能在植物體內(nèi)形成。植物體內(nèi)誘導(dǎo)形成植物螯合肽后，通過－SH絡(luò)合過量的重金屬，避免了重金屬以自由離子的形式在細胞內(nèi)循環(huán)，從而減少了重金屬對細胞的傷害。

多種金屬物質(zhì)比如 Ni、Zn、Pb、Cu、Hg、Au、Ag、Sn、Te、Bi的硝酸鹽和硫酸鹽或Se、As的陰離子都可以誘導(dǎo)植物螯合肽的產(chǎn)生。植物螯合肽在高等植物中普遍存在，但存在形式與植物種類有關(guān)。

2 植物螯合肽的結(jié)構(gòu)

植物螯合肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）3種氨基酸組成，一般化學(xué)式為（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）

Grill等人研究發(fā)現(xiàn)，某些植物與重金屬接觸，可以產(chǎn)生一系列與植物螯合肽結(jié)構(gòu)相似又不相同的化合物，稱為同源植物螯合肽。植物螯合肽與同源植物螯合肽有三個共同的特征：（1）谷氨酸（Glu）位于氨基酸的末端；（2）谷氨酸（Glu）相鄰的堿基為半胱氨酸（Cys），與谷氨酸（Glu） 以 - 羥基相連；（3）γ-Glu-Cys被重復(fù)兩次或更多次。所以，可以根據(jù)以上三個共同特征來識別γ-Glu-Cys肽，又根據(jù)羧基末端氨基酸的不同分為五類如圖1。

圖1 羧基末端氨基酸分類

3 植物螯合肽的研究方法

3.1 植物螯合素的生物合成

Grill等人發(fā)現(xiàn)，在許多植物種中存在著植物螯合肽酶促合成過程，而谷胱甘肽(GSH)是植物螯合肽合成的前體，酶促反應(yīng)受谷胱甘肽(GSH)、PCs-金屬螯合物、反應(yīng)產(chǎn)物及植物螯合肽的調(diào)節(jié)。例如，加入與金屬螯合足夠量的PC2[(γ-Glu-Cys)2-Gly]或PC7[(γ-Glu-Cys)7-Gly]，可以終止植物螯合肽合成反應(yīng)。另外添加其它螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA,Ethylenedi2aminetetraacetic acid)也能終止植物螯合肽合成反應(yīng)。

植物螯合肽合成酶(Mr95000)可能由四個亞基組成，其等電點為pH 4.8，最適pH 7.0，最適反應(yīng)溫度35℃。

根據(jù)Zenk的研究[2]，金屬-植物螯合肽螯合物的生物合成過程為：重金屬離子經(jīng)細胞壁和細胞膜，進入細胞質(zhì)并激活植物螯合肽合成酶，在胞質(zhì)內(nèi)以谷胱甘肽(GSH)為底物酶促合成植物螯合肽，使重金屬離子失去活性，從而避免一些酶受到損害。金屬-植物螯合肽螯合物在ATP的作用下可通過液泡膜轉(zhuǎn)運至液泡，液泡中金屬離子在酸性條件下，與有機酸結(jié)合并在該處累積，同時釋放出植物螯合肽，后者進一步降解為各種氨基酸，可以再轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)參與新的植物螯合肽的合成。

3.2 植物螯合肽的檢測

對于PCs的分析，通常是運用DTNB的方法，該方法是Grill等[3]人發(fā)明的。

鎘螯合肽 1999年，Ten-Yang Yen等運用nano－ESI－MS/MS和LC/ESI－MS/MS同時檢測到PC和PC-Cd的存在，并且第一次研究報道了植物組織中PC-Cd的大小和特性。Stefan Dring等，1999年運用mBrB和HPLC在鎘處理的黃瓜幼苗中檢測到PC，并且通過比較得出運用mBrB和HPLC從植物中檢測植物PCs是一種快速、可靠、靈敏的方法。

銅螯合肽 黃玉山[4]等人利用一次Sephadex G250凝膠過濾和2次QAESephadex A225離子交換層析的方法，用CuCl2處理(ρ=20mg/L)、在20天齡的紫羊茅(Festucarubra cv.Merlin)根中分離純化了一個銅結(jié)合肽。

4 結(jié)語

目前關(guān)于超積累植物的重金屬耐受機理研究已經(jīng)取得很大進展，主要有三方面：細胞區(qū)間隔離；重金屬結(jié)合肽的解毒作用；細胞活性氧防御酶系的誘導(dǎo)。植物螯合肽的發(fā)現(xiàn)為重金屬的解毒機理研究產(chǎn)生了一個新的突破，盡管植物螯合肽對重金屬的解毒作用已經(jīng)得到了許多方面的證實，但植物螯合肽與植物抗性的關(guān)系，不同學(xué)者的研究結(jié)果有不一致的地方，更加確切的機理需進一步研究。

[1]Grill E,Winnacker EL and Zenk MH.1985.Phytochelatins:the principalheavy-metalcomplexing peptides ofhigher plants[J].Science,230:674-676.

[2]Zenk MH.1996.Heavy metal detoxification in higher plants[J].Gene,179:21-30.

[3]Grill E,Winnacker EL,Zenk MH (1991).Methods Enzymol[C].205:333-341.

[4]黃玉山,邱國華.紫羊茅根銅結(jié)合肽的分離純化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,1998,4(4)：335-339.