轉(zhuǎn)番茄GGPS2基因煙草的構(gòu)建及弱光耐受性分析

李翠萍，董衛(wèi)華，張興國

?

轉(zhuǎn)番茄基因煙草的構(gòu)建及弱光耐受性分析

李翠萍1，董衛(wèi)華1，張興國2

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng) 453003 2 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

李翠萍, 董衛(wèi)華, 張興國. 轉(zhuǎn)番茄GGPS2基因煙草的構(gòu)建及弱光耐受性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 692–701.Li CP, Dong WH, Zhang XG. Construction of transgenic tobacco expressing tomato GGPS2 gene and analysis of its low light tolerance. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 692–701.

為探討弱光處理對轉(zhuǎn)番茄L.基因煙草的類胡蘿卜素、葉綠素合成及耐弱光性的影響，將基因和綠色熒光蛋白報(bào)告基因 () 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草L. cv. Wisconsin 38。PCR檢測證明抗卡那霉素?zé)煵莺?、基因，且無農(nóng)桿菌污染；熒光檢測發(fā)現(xiàn)，抗卡那霉素?zé)煵莸母獬尸F(xiàn)特有的熒光，由此說明獲得了整合和等外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草。弱光處理后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的類胡蘿卜素含量、葉綠素總量、光合速率、單位葉面積重、總干重、根冠干重比均比野生煙草高，達(dá)到了差異顯著水平。證實(shí)基因增加了弱光下煙草的類胡蘿卜素含量、葉綠素總量，增強(qiáng)了光合速率，促進(jìn)了生物量積累及其向根部的分配，提高了煙草弱光下的耐受性，推測可用于其他作物的耐弱光性改良。

煙草，番茄基因，類胡蘿卜素，葉綠素，光合速率，弱光耐受性

弱光是作物設(shè)施栽培、秋冬季農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和連綿陰雨期生長的主要障礙之一[1-3]。通過常規(guī)育種方法，可獲得耐弱光的新材料或新品種，但存在資源匱乏、改良困難、選擇周期長等局限性。發(fā)掘色素合成相關(guān)基因，可為作物耐弱光性的改良奠定基礎(chǔ)，對解決設(shè)施和寡日照地區(qū)的作物生產(chǎn)具有重要意義。在植物中，牻牛兒基牻牛兒焦磷酸 (GGPP) 參與葉綠素、類胡蘿卜素、維生素E、赤霉素等產(chǎn)物的合成[4-7]，對光合作用、生長發(fā)育、產(chǎn)品和品質(zhì)等有重要影響[8-9]。該產(chǎn)物由牻牛兒基牻牛兒焦磷酸合成酶 (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS) 催化合成[10-11]。植物中編碼的基因最早在甜椒中得到克隆[10]，且以多基因家族的形式存在[12]。擬南芥中有5個(gè)基因，其中和定位于質(zhì)體，和分布于線粒體，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，分別負(fù)責(zé)不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中GGPP的合成[12]。番茄中有2個(gè)基因，的mRNA主要出現(xiàn)在葉組織中，而在成熟果實(shí)和花器官中豐量表達(dá)[13]?；蚰苁勾竽c桿菌合成GGPP，從而協(xié)助八氫番茄紅素基因 () 和歐文氏菌的八氫番茄紅素脫飽含酶基因 () 合成番茄紅素[14]；三孢布拉氏霉菌的、基因能使大腸桿菌合成的β-類胡蘿卜素含量增加[15]；黃龍丹基因、蜜柑基因分別使煙草、獼猴桃類胡蘿卜素的含量增加[16-17]?；蛉裟艽龠M(jìn)類胡蘿卜素的合成，將會對植物光合作用產(chǎn)生影響，但能否促進(jìn)葉綠素合成，增強(qiáng)植物耐弱光性的研究，尚未見報(bào)道。本研究擬將CaMV 35S啟動子控制下的番茄基因整合進(jìn)煙草基因組，探討該基因?qū)煵莸娜~綠素和類胡蘿卜素合成及對光合作用、生長發(fā)育的影響，以期明確該基因是否能提高煙草的弱光耐受性，為其他作物耐弱光性改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄品種L. cv Ailsa Craig由重慶大學(xué)陳國平教授惠贈，煙草L. cv. Wisconsin 38無菌苗由實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌菌株XL1-blue、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105、Plant RNAzol試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。載體pET32a(+)購自Novagen公司，pVCT2024由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小抽提量試劑盒購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司，并委托該公司合成引物和測序。限制性內(nèi)切酶、PrimStar HS DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA marker購自TaKaRa公司。其他所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

基因的cDNA序列克隆自英國番茄成熟果實(shí)組織，含該基因的雙元表達(dá)載體由課題組構(gòu)建[18]，命名為pVCT2295。

1.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

將帶有35S-SlaGGPS2-Tnos基因表達(dá)盒和綠色熒光蛋白報(bào)告基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中，利用葉圓盤法轉(zhuǎn)化煙草[19]。不定芽誘導(dǎo)和選擇培養(yǎng)基均為MS附加2.5 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA、150 mg/L的卡那霉素、300 mg/L的羧芐青霉素、3%蔗糖和0.65%瓊脂。生根培養(yǎng)基為MS附加150 mg/L的卡那霉素、300 mg/L的羧芐青霉素、3%蔗糖和0.65%瓊脂。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

1.4.1 PCR鑒定

采用CTAB法提取野生型及抗卡那霉素?zé)煵萑~片基因組DNA。以野生煙草gDNA為陰性對照，稀釋20×pVCT2295 DNA為陽性對照，分別用引物對P1和P2、P1和P3、P4和P5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以排除農(nóng)桿菌污染造成的假陽性、檢測卡那霉素抗性基因和目的基因，序列見表1。

1.4.2 GFP蛋白的熒光檢測

分別將野生型、轉(zhuǎn)基因煙草組培苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，盡量不破壞根尖。取1 cm左右的根尖部位，制成臨時(shí)切片，用熒光顯微鏡 (D5000B，Leica公司) 分別于白光和470 nm藍(lán)光下觀察。

表1 引物序列

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草的耐弱光性檢測

1.5.1 弱光處理方法

將轉(zhuǎn)基因與野生型煙草組培苗同期繁殖，采用隨機(jī)排列的方式栽種于人工氣候室。盆栽土壤為腐殖質(zhì)土、粘土、沙土按1∶1∶1比例混勻。測定煙草的光響應(yīng)曲線，確定光補(bǔ)償點(diǎn)為20?25 μmol/(m2?s) 后，挑取形態(tài)正常、生長良好和整齊一致的3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系 (TG1、TG2、TG3) 和野生煙草 (WT) 進(jìn)行弱光處理。每株系處理3株，試驗(yàn)重復(fù)3次。

用T5植物生長燈控制光照強(qiáng)度，每天14 h光照/10 h黑暗，環(huán)境溫度為25 ℃。將煙草苗修剪為三葉一心，以免葉片數(shù)不同導(dǎo)致光合能力和生長的差異而影響后期測量。分別于25?30 μmol/(m2?s) 弱光照處理50 d，50?60 μmol/(m2?s) 弱光照繼續(xù)處理30 d、60 d后，測定葉綠素a、b含量，類胡蘿卜素含量等相關(guān)生理指標(biāo)。

1.5.2 光合速率測定

25?30 μmol/(m2?s) 光照處理50 d、 50?60 μmol/(m2?s) 光照繼續(xù)處理30 d后，選取野生煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的第5葉位功能葉，于9:00?11:00使用LI-6400便攜式光合儀 (LI-COR，美國) 在實(shí)際生長條件下測定凈光合速率。測定過程中使用開放氣路，光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2?s)，溫度為28 ℃。測定前，應(yīng)多次匹配，當(dāng)數(shù)據(jù)的讀數(shù)穩(wěn)定時(shí)，進(jìn)行記錄，求3次測定的平均值。

1.5.3 類胡蘿卜素和葉綠素含量的測定

用6 mm的打孔器在煙草自上而下的第5葉位 (第8葉位、第11葉位) 功能葉主脈兩側(cè)中部位置對稱取15個(gè)葉圓片，浸泡在15 mL 80%的丙酮溶液中，封口，避光放置于搖床上，于25 ℃、125 r/min振蕩至葉片變白[20]。當(dāng)葉片變白時(shí)，以UV-1800型分光光度計(jì)分別測定波長470 nm、646 nm和663 nm下的吸光度，計(jì)算葉綠素a (a)、葉綠素b (b)、總?cè)~綠素 (T) 及類胡蘿卜素 (c) 的質(zhì)量濃度，計(jì)算公式為：

a=(12.21?663–2.81?646)；

b=(20.13?646–5.03?663)；

T=a+b；

c=(1 000?470–3.27?a–104?b)/229。

然后根據(jù)?/計(jì)算各色素單位面積含量。

其中為吸光度；為質(zhì)量濃度；為測定液體總體積；為樣品的面積。

1.5.4 生長指標(biāo)的測定

葉數(shù)、株高、莖圍、單位葉面積重按煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)方法(YC/T 142-1998) 測定[21]；分別剪取根、莖、葉稱量鮮重，然后105 ℃殺青20 min，70 ℃烘干后稱量干重。于25?30 μmol/(m2?s) 光照處理50 d，50?60 μmol/(m2?s) 光照繼續(xù)處理90 d后測定煙草的株高、莖粗、植株鮮重、干重等生長指標(biāo)。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理方法

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算平均值和作圖。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 得到整合有等基因的煙草植株

含有等基因的雙元載體 (圖1A) 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草葉片組織，共得到33株Kan抗性植株 (圖1B?E)。PCR檢測鑒定出9株煙草同時(shí)具有Kan抗性基因和目的基因 (圖1F?G)，且檢測的DNA樣本無農(nóng)桿菌污染 (圖1H)。熒光檢測顯示，Kan抗性煙草的根尖表達(dá)有GFP蛋白，呈現(xiàn)其特有的綠色熒光 (圖1I?L)。證實(shí)獲得整合、和等外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草9株。

圖1 SlaGGPS2基因轉(zhuǎn)煙草植株的鑒定

2.2 轉(zhuǎn)基因能增強(qiáng)弱光下煙草的光合性能和生物量積累

2.2.1 不同弱光處理對轉(zhuǎn)基因煙草光合性能的影響

25?30mmol/(m2?s) 弱光照處理50 d后，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第5功能葉的類胡蘿卜素含量分別比野生煙草增加13%、4%，葉綠素總量分別比野生煙草增加19%、12%，而株系TG3的類胡蘿卜素含量與野生煙草相當(dāng)，葉綠素總量比野生煙草增加12%，均未達(dá)到差異顯著水平；所有轉(zhuǎn)基因煙草株系第5功能葉的光合速率較野生煙草增加25%?35.5%，均達(dá)到差異顯著水平 (<0.05) (表2)。

50?60mmol/(m2?s) 弱光照處理30 d后，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第5功能葉的類胡蘿卜素含量分別比野生煙草增加18%、16%，葉綠素總量分別比野生煙草增加23%、25%，達(dá)到差異顯著水平 (<0.05)；而株系TG3的類胡蘿卜素含量比野生煙草低3%，葉綠素總量比野生煙草低4%，所有轉(zhuǎn)基因煙草株系第5功能葉的光合速率較野生煙草增加1.8%?11.7%，未達(dá)到差異顯著水平 (表2)。

2.2.2 弱光處理對轉(zhuǎn)基因煙草不同部位葉片光合性能的影響

50?60mmol/(m2?s) 弱光照處理60 d后，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第5功能葉的類胡蘿卜素含量分別比野生煙草增加6%、5%，葉綠素總量分別比野生煙草增加5%、3%，而株系TG3的類胡蘿卜素含量、葉綠素總量分別比野生煙草降低4%、8%；所有轉(zhuǎn)基因煙草第5功能葉的光合速率較野生煙草增加2%?8%，均未達(dá)到差異顯著水平 (表3)。

表2 不同弱光處理對轉(zhuǎn)SlaGGPS2基因煙草色素含量和光合速率的影響

WT: wild tobacco; TG1, TG2, TG3: different lines of transgenic tobacco; values are(=3); ** and * indicate 1%, 5% significant level respectively.

WT: wild tobacco; TG1, TG2, TG3: different lines of transgenic tobacco; ND: not detected; values are(=3).

轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第8功能葉的類胡蘿卜素含量分別比野生煙草增加18%、4%，葉綠素總量分別比野生煙草增加14%、9%，而株系TG3的類胡蘿卜素含量、葉綠素總量分別比野生煙草降低10%、13%，均未達(dá)到差異顯著水平 (表3)。

所有轉(zhuǎn)基因煙草株系第11功能葉的類胡蘿卜素含量比野生煙草增加13%?23%，葉綠素總量比野生煙草增加8%?21%，差異均不顯著 (表3)。

2.2.3 弱光處理對轉(zhuǎn)基因煙草生物量積累的影響

25?30mmol/(m2?s) 光照處理50 d， 50?60 μmol/(m2?s) 光照處理90 d后，相比野生煙草，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1、TG2的葉片數(shù)目分別增加12%、6% (圖2A)，株高分別增加14%、3% (圖2C)，而轉(zhuǎn)基因煙草株系TG3的葉片數(shù)目減少7%，株高降低5% (圖2A，2C)，轉(zhuǎn)基因煙草莖比野生煙草粗6%?11%，均未達(dá)到差異顯著性水平 (圖2B)。

轉(zhuǎn)基因煙草的單位葉面積比野生煙草重14%?26%，達(dá)到差異顯著性水平 (<0.05)；葉鮮重比野生煙草低5%?20%，其中株系TG3達(dá)到差異顯著性水平 (<0.05)；除株系TG3外莖鮮重比野生煙草高2%?16%，差異不顯著；根鮮重比野生煙草增加55%?95%，達(dá)到差異極顯著水平 (<0.01)；株系TG1總鮮重的增加達(dá)到差異顯著性水平 (<0.05)；烘干后稱重，發(fā)現(xiàn)相比野生煙草，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2的葉干重分別增加8%、5%，TG3的葉干重減少1%，差異均不顯著；轉(zhuǎn)基因煙草的莖干重、根干重、總干重分別比野生煙草增加16%?47%、39%?67%、9%?26%，達(dá)到差異顯著性水平 (<0.05)，表明轉(zhuǎn)基因煙草的生物量積累比野生煙草多。

相比野生煙草，轉(zhuǎn)基因煙草的干鮮比增加17%?28%，達(dá)到差異極顯著性水平 (<0.01)，表明轉(zhuǎn)基因煙草的自由水含量比野生煙草低，造成其葉鮮重偏低、總鮮重不高；轉(zhuǎn)基因煙草的根冠干重比增加28%?37%，達(dá)到差異極顯著性水平 (<0.01)，表明其積累的生物量更多向根部運(yùn)輸，培養(yǎng)了發(fā)達(dá)的根系，是煙草壯苗的基礎(chǔ)和標(biāo)志 (表4)。

表4 弱光下轉(zhuǎn)SlaGGPS2基因煙草的生物量積累

WT: wild tobacco; TG1, TG2, TG3: different lines of transgenic tobacco; LMA: leaf mass per unit area; FW: fresh weight; DW: dry weight; values are(=3); ** and * indicate 1%, 5% significant level respectively.

3 討論

弱光是影響作物設(shè)施生產(chǎn)的重要因素之一，不僅會限制農(nóng)作物的種植范圍，也會造成農(nóng)作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收，因?yàn)楣庹帐侵参镞M(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)，其強(qiáng)度變化會影響葉綠體光合膜上的色素、色素蛋白復(fù)合體的形成、含量及分布，進(jìn)而影響植物的生長與發(fā)育[23-24]。因此，有效捕獲低光照強(qiáng)度下的光能，增強(qiáng)植物光合利用率將是提高植物耐弱光的重要措施之一。基因編碼合成的GGPP是類異戊二烯代謝體系的分支，可通過不同的代謝途徑分別合成葉綠素和類胡蘿卜素，將該基因轉(zhuǎn)入作物中有望提高耐弱光性。

本研究將構(gòu)建的帶有35S-SlaGGPS2-Tnos基因表達(dá)盒和綠色熒光蛋白報(bào)告基因的植物雙元表達(dá)載體 (圖1A) 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法整合入煙草葉片基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第5功能葉的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量較野生煙草增加，光合速率增強(qiáng)，尤其是25?30mmol/(m2?s) 弱光照處理50 d后，光合速率增加25%?35.5%，達(dá)到差異極顯著性水平 (<0.01) (表2)。當(dāng)50?60mmol/(m2?s) 弱光照處理30 d后，轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2第5功能葉的類胡蘿卜素含量較野生煙草分別增加18%、16%，葉綠素總量分別增加23%、25%，達(dá)到差異顯著水平 (<0.05) (表3)。表明基因轉(zhuǎn)煙草后得到表達(dá)并發(fā)揮了促進(jìn)類胡蘿卜素和葉綠素合成的功能。株系TG3的葉綠素總量、類胡蘿卜素含量與野生煙草差異不顯著，可能由于基因插入的位置效應(yīng)造成。Ji等[16]將黃龍丹基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草類胡蘿卜素含量比野生煙草增加小于20%，該基因?qū)︻惡}卜素含量的影響不及、基因，但并未對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行耐弱光性分析。Lintig等[22]認(rèn)為在光形態(tài)建成中，葉綠素總量和類胡蘿卜素含量是同步增長的，本研究中發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素與葉綠素含量變化趨勢一致，同時(shí)對不同部位葉片的類胡蘿卜素、葉綠素含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著葉片位置的下降，類胡蘿卜素、葉綠素含量呈下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草比野生煙草下降趨勢減緩，差異均不顯著 (表3)，可能與GGPP還參與赤霉素、脫落酸等激素的合成相關(guān)。本研究中轉(zhuǎn)基因煙草株系TG1和TG2經(jīng)25?30mmol/(m2?s) 光照處理50 d后，在葉綠素指標(biāo)上不及50?60mmol/(m2?s) 光照處理30 d后的結(jié)果 (表2和表3)，表明基因可能只在較強(qiáng)弱光下發(fā)揮作用，而在接近光補(bǔ)償點(diǎn)的弱光下，其功能有限。因此，導(dǎo)入更多與葉綠素或類胡蘿卜素合成相關(guān)基因?qū)υ鰪?qiáng)煙草的耐弱光性有重要的研究意義[25]。另外，在后續(xù)研究中通過對轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株的PCR鑒定，結(jié)果表明含目的基因與不含目的基因植株的比例接近3∶1，推測基因應(yīng)該為單拷貝插入。

光合作用為植物提供物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化的最初來源，是決定作物產(chǎn)量的重要因素。弱光影響光合作用的因素包括光合速率、色素含量、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、光合酶活性、光合產(chǎn)物的運(yùn)輸與分配等。本研究將色素合成相關(guān)基因?qū)霟煵?，發(fā)現(xiàn)弱光處理后，光合速率增強(qiáng)，單位葉面積增重、總干重增加，可見轉(zhuǎn)基因煙草積累了更多的生物量；同時(shí)發(fā)現(xiàn)根鮮重、根干重、根冠干重量比增加，證明轉(zhuǎn)基因煙草增加了生物量向根部的分配，培養(yǎng)了發(fā)達(dá)的根系。由干鮮比的增加可見，轉(zhuǎn)基因煙草的自由水含量少，可能與其耐弱光性增強(qiáng)有關(guān)。

番茄基因能使弱光下轉(zhuǎn)基因煙草葉片的類胡蘿卜素含量、葉綠素含量增加，光合速率增強(qiáng)，干物質(zhì)累積增多，因而推測在用于其他作物的耐弱光改良上可能發(fā)揮作用。

REFERENCES

[1] Barkey KO, Wells R. Response of soybean photosynthesis and chloroplast membrane function to canopy development and mutual shading. Plant Physiol, 1991, 97(1): 245–252.

[2] Chen QJ, Zhang FM, Wang YJ, et al. Studies of physiologic characteristics of reaction of cucumber to low temperature and poor light. Sci Agric Sin, 2003, 36(1): 77–81 (in Chinese).陳青君, 張福墁, 王永健, 等. 黃瓜對低溫弱光反應(yīng)的生理特征研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36(1): 77–81.

[3] Ai XZ, Guo YK, Ma XZ, et al. Photosynthetic characteristics and ultrastructure of chloroplast of cucumber under low light intensity in solar green house. Sci Agric Sin, 2004, 37(2): 268–273 (in Chinese).艾希珍, 郭延奎, 馬興莊, 等. 弱光條件下日光溫室黃瓜需光特性及葉綠體超微結(jié)構(gòu). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(2): 268–273.

[4] Bartley GE, Scolnik PA. Plant carotenoids: pigments for photoprotection, visual attraction, and human health. Plant Cell, 1995, 7(7): 1027–1038.

[5] Koornneef M, Léon-Kloosterziel KM, Schwartz SH, et al. The genetic and molecular dissection of abscisic acid biosynthesis and signal transduction in. Plant Physiol Biochem, 1998, 36(1): 83–89.

[6] Andrew LP. Gibberellins in. Plant Physiol Bioch, 1998, 36: 115–124.

[7] Wettstein DV, Gough S, Kannangara CG. Chlorophyll biosynthesis. Plant Cell, 1995, 7(7): 1039–1057.

[8] Bramley PM. Regulation of carotenoid formation during tomato fruit ripening and development. J Exp Bot, 2002, 531(377): 2107–2113.

[9] Oster U, Rudiger W. The G4 gene ofencode a chlorophyll synthase of etiolated plants. Bot Acta, 1997, 110(5): 420–423.

[10] Kuntz M, Romer S, Suire C. Identification of a cDNA for the plastid-located geranylgeranyl pyrophosphate synthase from: correlative increase in enzyme activity and transcript level during fruit ripening. Plant J, 1992, 2(1): 25–34.

[11] Wu ZM, Zhang X, Wan JM. Molecular regulation of chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol Comm, 2008, 44(6): 1064–1070 (in Chinese).吳自明, 張欣, 萬建民. 葉綠素生物合成的分子調(diào)控. 植物生理學(xué)通報(bào), 2008, 44(6): 1064–1070.

[12] Okada K, Saito T, Nakagawa T, et al. Five geranylgeranyl diphosphate synthases expressed in different organs are localized into three subcellular compartments in. Plant Physiol, 2000, 122(4): 1045–1056.

[13] Ament K, Van Schie CC, Bouwmeester HJ, et al. Induction of a leaf specific geranylgeranyl pyrophosphate synthase and emission of (E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene in tomato are dependent on both jasmonic acid and salicylic acid signaling pathways. Planta, 2006, 224(5): 1197–1208.

[14] Chen JY, Pu ZQ, Xiao YW, et al. Lycopene synthesis via tri-cistronic expression of,andin. Chin J Biotech, 2012, 28(8): 823–833 (in Chinese).陳吉裕, 蒲志群, 肖雅文, 等. 大腸桿菌共表達(dá)、和基因合成番茄紅素. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(7): 823–833.

[15] Sun J, Sun XX, Tang PW, et al. Molecular cloning and functional expression of two key carotene synthetic genes derived fromintofor increased β-carotene production. Biotechnol Lett, 2012, 34(11): 2077–2082.

[16] Ji J, Wang G, Wang JH. Functional analysis of multiple carotenogenic genes fromandL. for their effects on β-carotene production in transgenic tobacco. Biotechnol Lett, 2009, 31(2): 305–312.

[17] Kim M, Kim SC, Song KJ, et al. Transformation of carotenoid biosynthetic genes using a micro-cross section method in kiwifruit. Plant Cell Rep, 2010, 29(12): 1339–1349.

[18] Li CP, Xia BB, Zhai JP, et al. Cloning and expression vector construction of thegene from tomato. J Southwest Univ: Nat Sci Ed, 2010, 32(10): 65–68 (in Chinese).李翠萍, 夏蓓蓓, 翟軍鵬, 等. 番茄基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建. 西南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 32(10): 65–68.

[19] Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, et al. A simple and general method of transferring genes into plants. Science, 1985, 227(4691): 1229–1231.

[20] Xu DQ. Several problems in measurement and application of chlorophyll content. Plant Physiol Comm, 2009, 45(9): 896–898 (in Chinese).許大全. 葉綠素含量的測定及其應(yīng)用中的幾個(gè)問題. 植物生理學(xué)通訊, 2009, 45(9): 896–898.

[21] State tobacco monopoly administration. Investigation Methods of Agronomical Character of Tobacco (YC/T 142). Beijing: China Standard Press, 1998 (in Chinese).國家煙草專賣局. 煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法 (YC/T 142). 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1998.

[22] Lintig JV, Welsch R, Bonk M, et al. Light-dependent regulation of carotenoid biosynthesis occurs at the level of phytoene synthase expression and is mediated by phytochrome inandseedlings. Plant J, 1997, 12(3): 625–634.

[23] Pattanayak GK, Biswal AK, Reddy VS, et al. Light-dependent regulation of chlorophyll b biosynthesis in chlorophyllide a oxygenase overexpressing tobacco plants. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 326(2): 466–471.

[24] Tanaka R, Koshino Y, Sawa S, et al. Overexpression of chlorophyllide a oxygenase enlarges the antenna size of photosystem II in. Plant J, 2001, 26(4): 365–373.

[25] Li CP, Pan Y, Chu FT, et al. Construction of co-expression vector containingandgenes fromand transformation into tobacco. China Biotechnol, 2013, 33(4): 54–60 (in Chinese).李翠萍, 潘宇, 儲福堂, 等. 擬南芥和基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)煙草研究. 中國生物工程雜志, 2013, 33(4): 54–60.

(本文責(zé)編郝麗芳)

Construction of transgenic tobacco expressing tomatogene and analysis of its low light tolerance

Cuiping Li1, Weihua Dong1, and Xingguo Zhang2

1,,453003,,2,,,400715,

To explore the influence of lowlight on the synthesis of carotenoids, chlorophyll and the adaptability oftransgenic plants with tomatoL.gene, we constructed a vector containingagene with green fluorescent protein () as report gene under the control of a cauliflower mosaic virus 35S promoter and introduced it into tobaccoL. cv. Wisconsin 38 bytumefaciens-mediated transformation. PCR analysis of the DNA from kanamycin resistant tobacco indicated that the transgenic tobacco containing thegene,gene and without contamination of. We also detected the root tip of kanamycin resistant tobacco showing characteristic fluorescence. The contents of carotenoid, chlorophyll and photosynthesis of transgenic tobacco increased in comparison with wild tobacco after low light treatment. In addition, leaf mass per unit area, total dry weight, ratio of root to shoot in transgenic tobacco were all higher than that of the wild tobacco, which proved that the transgenic tobacco could increase the accumulation of biomass and promote it transport to root. The transgenic tobacco withgene can increase the contents of carotenoid, chlorophyll, enhance the photosynthetic rate, promote the biomass accumulation and its distribution to root. Hence, the transgenic tobacco withgene had increased low light tolerance and thegene maybe can be used in other crops.

tobacco, thegene from tomato, carotenoids, chlorophyll, photosynthesis, low light resistant

October 1, 2014; Accepted:December 15, 2014

Cuiping Li. Tel: +86-373-3029127; E-mail: lcp831220@163.com

Supported by:the Doctoral Fund of Xinxiang Medical College (No. 505026).

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士科研啟動資金 (No. 505026) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-03-25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150325.1106.001.html