靶向膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶反義肽的虛擬篩選與分子模擬

曾麗，譚博文，楊亞藍(lán)，邱槿怡，熊莉麗，茆燦泉

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靶向膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶反義肽的虛擬篩選與分子模擬

曾麗，譚博文，楊亞藍(lán)，邱槿怡，熊莉麗，茆燦泉

西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院分子進(jìn)化與應(yīng)用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610031

曾麗, 譚博文, 楊亞藍(lán), 等. 靶向膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶反義肽的虛擬篩選與分子模擬. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 269–280.Zeng L, Tan BW, Yang YL, et al. Virtual screening and molecular simulations of antisense peptides targeting MT1-MMP. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 269–280.

膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶 (Membrane type-1 matrix metalloproteinase, MT1-MMP, MMP14) 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要作用，是腫瘤潛在理想的藥物靶標(biāo)。為了獲得MT1-MMP結(jié)合肽，我們首先采用生物信息學(xué)方法分析MMPs序列，獲得MT1-MMP差異大且特異的序列。以此為正義肽靶標(biāo)，設(shè)計(jì)反義肽庫，然后通過分子對接、分子動力學(xué)模擬以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等多種方法，進(jìn)行靶向MT1-MMP反義肽的篩選與活性研究。多序列比對確定了位于MT1-MMP環(huán)區(qū)的特異序列AYIREGHE (簡稱MT1-loop)，并構(gòu)建1 536條反義肽。經(jīng)兩輪虛擬篩選，選取打分位于前五的反義肽用于后續(xù)研究。該五條反義肽與MT1-MMP存在較強(qiáng)的相互作用且能很好地對接于正義肽區(qū)域。進(jìn)一步分析其與MMPs其他家族成員 (MMP1-3, MMP7-13, MMP14 HPX, MMP16) 的親和力，發(fā)現(xiàn)反義肽FVTFPYIR對MT1-MMP具有更強(qiáng)的特異性。分子動力學(xué)模擬表明，反義肽FVTFPYIR可能是通過影響受體MT1-MMP的構(gòu)象穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其功能活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步確定反義肽FVTFPYIR可選擇性地抑制表達(dá)MT1-MMP的人成骨肉瘤細(xì)胞MG63和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。本研究為抗腫瘤反義肽先導(dǎo)藥物的研發(fā)提供了一種新的思路與途徑。

膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶 (MT1-MMP，MMP14)，反義肽，分子對接，分子動力學(xué)模擬

基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases, MMPs) 屬于鋅離子依賴性內(nèi)肽酶家族成員，參與體內(nèi)多種生理和病理過程。研究顯示，MMPs的過量表達(dá)在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和新生血管形成中起著重要的作用，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長和信號傳遞等密切相關(guān)。作為MMPs家族的重要成員之一，MT1-MMP能夠直接或間接降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分如纖連蛋白、層粘蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型膠原[1]，并調(diào)控許多細(xì)胞粘附和信號受體功能。它在多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移，同時MT1-MMP的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞在3D膠原基質(zhì)中生長至關(guān)重要的。MT1-MMP具有MMPs成員的典型結(jié)構(gòu)：前肽結(jié)構(gòu)區(qū)、催化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和血紅素樣結(jié)構(gòu)域 (HPX)[2-3]，同時具有跨膜區(qū)、胞質(zhì)尾端以及furin蛋白識別等位點(diǎn)。其中催化結(jié)構(gòu)域是MT1-MMP致癌特性最重要的區(qū)域[4]，被認(rèn)為是惡性腫瘤適宜的藥物靶點(diǎn)而成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[5-6]。隨著HPX[4,7-10]、跨膜胞質(zhì)區(qū)[11]等其他區(qū)域作用功能的逐漸闡明，MT1-MMP在整個腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用被更加確定。

反義肽即DNA反義鏈編碼的多肽，如同DNA正義鏈和反義鏈那樣，其與正義肽也存在相互作用。目前有Mekler-Idlis (M-I) 配對理論、AHBs (反義同源盒) 理論和分子識別理論對其作用原理和機(jī)制進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述[12]，其相互作用主要是疏水性、靜電引力、氫鍵。反義肽和正義肽之間特殊的作用模式，已被用于多個領(lǐng)域，如Jackson等用血管緊張素Ⅱ的反義肽證實(shí)了反義肽的藥物功能。作為一種新型多肽先導(dǎo)藥物來源，反義肽在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的研發(fā)前景。

國內(nèi)外有大量的MMPs抑制劑 (Matrix metalloproteinase inhibitors, MMPIs) 研究報(bào)道，但大部分的MMPIs被扼殺在Ⅱ、Ⅲ臨床階段[13]，其主要原因是MMPs家族序列同源性高、功能區(qū)域三級結(jié)構(gòu)相似，所研發(fā)的MMPIs廣譜作用而缺乏選擇性，以致特異性低和毒副作用大。篩選和獲得高選擇性的MMPIs已成為該領(lǐng)域研發(fā)的關(guān)鍵。本研究以MT1-MMP膜表面蛋白為對象，采用生物信息學(xué)與基于反義肽理論的虛擬篩選技術(shù)，篩選與發(fā)現(xiàn)分子靶向MT1-MMP特異區(qū)域的結(jié)合肽，期望為靶向MT1-MMP抗腫瘤反義肽先導(dǎo)藥物的研發(fā)提供一種新的思路與途徑。

1 材料與方法

1.1 材料及數(shù)據(jù)來源

MMPs蛋白序列下載自NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)，MMPs三維結(jié)構(gòu)下載自PDB數(shù)據(jù)庫 (http://www.rcsb.org/ pdb/home/home.do)，蛋白序列及三維結(jié)構(gòu)信息見表1；人成骨肉瘤MG63、乳腺癌MCF7為本實(shí)驗(yàn)室保存，人乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞為成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系余小平教授惠贈；FITC標(biāo)記和不標(biāo)記的多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成 (純度99%)；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM粉末和胎牛血清購自Gibco公司；MTT購自Amresco公司；其他試劑均購自成都試劑公司，化學(xué)試劑為分析純。

表1 MMPs三維結(jié)構(gòu)信息

1.2 序列分析與反義肽設(shè)計(jì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載所有人類MMPs (MMP1-3、MMP7-17、MMP19-21、MMP23-28) 等23種已知的蛋白質(zhì)序列，利用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對及多重序列比對，獲得與MMPs其他家族成員差異性大、MT1-MMP特異的多肽序列。以該特異序列為正義肽，根據(jù)Meker-Idlis (M-I) 理論，設(shè)計(jì)相應(yīng)的反義肽，運(yùn)用Discovery Studio (DS) 2.0軟件中的Protein Modeling模塊構(gòu)建反義肽的三維結(jié)構(gòu)，采用CHARM力場進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

1.3 虛擬篩選

為獲得MT1-MMP特異性結(jié)合的反義肽，利用DS2.0中的Libdock模塊和Molegro Virtual Docker (MVD) 分子對接軟件進(jìn)行兩輪篩選。 Libdock初篩以MT1-MMP催化域?yàn)槭荏w，以構(gòu)建的反義肽庫為配體，正義肽為對接中心，半徑16.5 ?，每次保留10個構(gòu)象，配體構(gòu)象產(chǎn)生方法為best，Hotspots為150，其他參數(shù)默認(rèn)，對接結(jié)果以Libdockscore排序。第二輪采用MVD重篩，使用半柔性對接，對接算法采用MolDock Optimizer，每個配體運(yùn)行10次，每次最大迭代5 000步，對接結(jié)果以Rerankscore排序。

1.4 反義肽與其他MMPs成員分子對接

為了確定虛擬篩選獲得的反義肽對MT1-MMP的特異性，以經(jīng)上述兩輪篩選獲得的反義肽為配體，利用MVD軟件對PDB數(shù)據(jù)庫中包括MT1-MMP的HPX結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的已解析三維結(jié)構(gòu)的MMPs成員進(jìn)行分子對接研究，對接方法參照1.3。

1.5 空載體與復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬和結(jié)果處理分別采用NAMD和VMD1.9.1軟件。蛋白質(zhì)-反義肽溶質(zhì)化采用邊長為70 nm的立方體，加入0.15 mmol/L的NaCl。先限制蛋白及反義肽，進(jìn)行能量最小化 (10 000步，步長2 fs) 和能量平衡 (200 000步，步長2 fs)，然后允許蛋白、反義肽和水分子同時運(yùn)動，再進(jìn)行能量最小化 (10 000步，步長2 fs) 和能量平衡 (2 500 000步，步長2 fs)。分子動力學(xué)模擬采用CHARM力場，使用恒溫310 K和常壓1×105Pa。

1.6 體外腫瘤細(xì)胞活力測定

MG63、MDA-MB-231、MCF7、MDA-MB-453細(xì)胞復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)，以5×103個細(xì)胞/孔的濃度鋪于96孔板中培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的合成肽 (0.1、1、10、100 μg/mL，=6) 繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后多肽換液一次，48 h后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與MTT測定，方法參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.7 合成肽體外細(xì)胞親和力測定

選用MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞，以5×103個細(xì)胞/孔的濃度鋪于96孔板中培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的FITC標(biāo)記的多肽 (0.1、1、10、50、100 μg/mL，=5) 繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后熒光觀察后換多肽液一次，48 h再進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT1-MMP特異的多重序列分析及反義肽設(shè)計(jì)

對23種已知的人MMPs家族成員進(jìn)行多重序列比對。根據(jù)比對結(jié)果，以MT1-MMP為研究對象，選取與其他MMPs家族成員序列差異性相對較大的AYIREGHE (簡稱MT1-loop) 作為MT1-MMP的特異序列(圖1)，該序列位于MT1-MMP的催化結(jié)構(gòu)域。以此為正義肽，運(yùn)用Meker-Idlis (M-I) 理論，設(shè)計(jì)反義肽，共獲得1 536條反義肽(表2)。

圖1 ClustalX多序列比對人MMPs序列

2.2 虛擬篩選及反義肽與MMPs的分子對接

Libdock對接打分具有速度快和能夠并行運(yùn)算等特點(diǎn)，廣泛用于大規(guī)模的分子對接模擬與快速篩選；MVD則可根據(jù)配體準(zhǔn)確預(yù)測大分子蛋白的活性位點(diǎn)，是一款精確的半柔性分子對接軟件，適合于二次篩選或精篩。經(jīng)過Libdock第一輪篩選，共獲得96條LibDockScore高于200的反義肽，再將其進(jìn)行MVD第二輪篩選，Rerankscore分值前5位的反義肽分別為FVTFPYIR、LVSFPYVR、FVTFSYVG、FMAFSYVS和FVTLPYVR，后者對接結(jié)果和參數(shù)見圖2和表3。

表2 基于Meker-Idlis (M-I) 理論設(shè)計(jì)反義肽

圖2 反義肽與MT1-MMP分子對接圖

表3 反義肽與MT1-MMP催化域的對接參數(shù)

以反義肽FVTFPYIR與MT1-MMP催化域?qū)咏Y(jié)果為例，圖3展示兩者間的相互作用方式。首先，反義肽的Phe4與MT1-MMP的Gln129、Arg8與MT1-MMP的Arg168及Glu169形成3個穩(wěn)定的氫鍵 (圖3A)；另一方面，反義肽位于Ala165、Ile167、Gly170和Phe180等氨基酸形成的疏水腔中，兩者之間存在較強(qiáng)的疏水作用 (圖3B)；同時，該反義肽與受體間存在著較強(qiáng)的靜電作用力 (表3，圖3C)。綜合分析，F(xiàn)VTFPYIR與MT1-MMP結(jié)合的主要驅(qū)動力是疏水作用力、氫鍵以及靜電作用力。

與其他MMPs家族成員的分子對接結(jié)果表明，相對于其他4條反義肽，多肽FVTFPYIR特異性更好。除MMP13外，F(xiàn)VTFPYIR與其余的MMPs家族成員的對接能量均高于MT1-MMP (表4)。

表4 反義肽與MMPs家族成員分子對接的Rerankscores值(kJ/mol)

* indicates the rerankscore was better than those docking to the catalytic of MT1-MMP.

2.3 反義肽與MT1-MMP的分子動力學(xué)模擬

為深入了解所確定的反義肽與MT1-MMP的作用模式，對每個復(fù)合物體系進(jìn)行了5 ns的常規(guī)分子動力學(xué)模擬，用均方根偏差 (Root mean square deviation，RMSD) 評價(jià)體系的穩(wěn)定性。圖4顯示動力學(xué)模擬過程中MT1-MMP和反義肽主鏈骨架的RMSD的變化情況，起初 0.5 ns，蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)優(yōu)化主鏈的RMSD上升較快。首先模擬MT1-MMP在水溶質(zhì)中的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在1.7 ns后就達(dá)到平衡狀態(tài)，RMSD約 0.35 nm (圖4A)。而在MT1-MMP-FVTFPYIR復(fù)合物中，MT1-MMP的RMSD呈上升趨勢，配體約在3.5 ns達(dá)到平衡狀態(tài) (圖4B)，這說明配體能夠引起MT1-MMP的不穩(wěn)定，推測MT1-MMP的功能活性受到影響。在其他模擬過程中發(fā)現(xiàn)，反義肽LVSFPYVR、FVTFSYVG能穩(wěn)定MT1-MMP其RMSD均在0.25 nm左右，而反義肽自身的RMSD波動較大 (圖4C–E)；FVTLPYVR、FMAFSYVS體系在2 ns后均達(dá)到穩(wěn)定 (圖4F)。

2.4 反義肽對腫瘤細(xì)胞活力的抑制及親和力

為了確認(rèn)虛擬篩選獲得的反義肽是否對腫瘤細(xì)胞真實(shí)有效，綜合分子對接和分子動力模擬結(jié)果，選取反義肽FVTFPYIR作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的候選肽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用該反義肽作用腫瘤細(xì)胞 48 h后，加藥組MG63細(xì)胞密度明顯低于對照組(圖5)，MDA-MB-231也有著相似的變化，而MDA-MB-453和MCF7差異不明顯，且MDA-MB-453實(shí)驗(yàn)組較對照組有相逆的趨勢 (后三者圖未顯示)；MTT測定顯示，MG63細(xì)胞增殖受到明顯抑制，隨著多肽濃度的增大，抑制作用也增強(qiáng)，呈劑量依賴關(guān)系 (圖6A)，同樣反義肽也能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖 (圖6B)；與之不同的是，反義肽對MCF7細(xì)胞活力幾乎無劑量依賴抑制作用，對MDA-MB-453細(xì)胞在低劑量下促進(jìn)其生長，高劑量下抑制其生長 (結(jié)果未顯示)。

圖4 MD模擬過程中MT1-MMP及反義肽主鏈骨架的RMSD值

圖5 倒置顯微鏡下MG63細(xì)胞形態(tài)的變化(100×)

MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞親和力測定結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL的反義肽共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞檢測到熒光信號；而培養(yǎng)48 h后，100 μg/mL和50 μg/mL的反義肽共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞均檢測到熒光信號，濃度越大，熒光信號越強(qiáng) (圖7)。但無論培養(yǎng)24 h還是48 h，MCF7細(xì)胞均檢測不到熒光。

圖6 FVTFPYIR對腫瘤細(xì)胞活力的影響

圖7 FVTFPYIR與MDA-MB-231細(xì)胞親和力檢測結(jié)果(200×)

3 討論

MMPs家族成員具有高度的同源性，加之MMPs各成員對機(jī)體作用不一，導(dǎo)致靶向MMPs抗腫瘤抑制劑研發(fā)十分困難。因此，尋找合適的MMPs家族成員以及序列及功能差異性大的區(qū)域作為其藥物篩選的靶標(biāo)是解決此問題的關(guān)鍵。MT1-MMP作為MMPs家族的重要成員，參與proMMP2的激活，直接或間接降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種組分。一方面它是細(xì)胞表面膜蛋白，可以克服靶向胞內(nèi)蛋白藥物需要進(jìn)入細(xì)胞的難點(diǎn)，同時其被認(rèn)為是MMPs 家族中與腫瘤關(guān)系最密切的酶[15]，因此，MT1-MMP是MMPs家族中最理想的抗腫瘤藥物篩選靶蛋白之一[4]。不僅如此，在MT1-MMP的催化域上存在一段獨(dú)特的序列MT-loop (aa.163–170)，有研究表明，MT-loop對proMMP2有效激活是不可缺少的。綜合考慮以上因素，我們選取MT1-MMP的特有序列MT1-loop為靶標(biāo)進(jìn)行反義肽庫的虛擬篩選與研究。與國內(nèi)房學(xué)訊實(shí)驗(yàn)室[6]開展的靶向MT1-MMP loop區(qū) (aa.160–174)的噬菌體隨機(jī)肽庫篩選不同的是，本研究在多重序列比對分析的基礎(chǔ)上，確定和選取的MT1-loop區(qū)序列更短既利于正義肽的選擇和反義肽庫的設(shè)計(jì)，差異性又更強(qiáng)。以MT1-loop作為研究靶標(biāo)，有望獲得MT1-MMP特異性的抑制劑和先導(dǎo)藥物，同時因?yàn)镸T1-loop位于MT1-MMP三維結(jié)構(gòu)的表面，更利于藥物作用的直接發(fā)揮。

多肽藥物具有與靶蛋白結(jié)構(gòu)相容性高、能有效破壞蛋白-蛋白作用界面以及分子量小等優(yōu)點(diǎn)，加上近年在藥物修飾、給藥途徑以及膜滲透等領(lǐng)域的突破，使得多肽藥物又引起了極大的關(guān)注[16]，2012年FDA批準(zhǔn)了6個多肽藥物上市便是很好的說明。自2005年始，本實(shí)驗(yàn)室致力于靶向MT1-MMP的多肽抑制劑篩選與研究并取得了一定的成效[10,13-14,17]。本研究運(yùn)用反義肽原理設(shè)計(jì)靶向MT1-loop的反義肽庫，依次采用Libdock和MVD分子對接軟件進(jìn)行虛擬篩選。綜合兩種軟件的對接結(jié)果，獲得高效可靠的目標(biāo)反義多肽，最終選取了綜合排名前五位的反義肽進(jìn)一步的研究分析。首先從理論上考察其專一性，即采用分子模擬與對接分析反義肽與已解析三維結(jié)構(gòu)的MMPs的作用特性，由于在PDB數(shù)據(jù)庫中已解析的大多數(shù)MMPs三維結(jié)構(gòu)并非全長，又基于正義肽位于MT1-MMP的催化域中，因此在選擇MMPs三維結(jié)構(gòu)時也主要將相應(yīng)的催化域作為研究對象，其中MMP20三維結(jié)構(gòu)太大，沒有對其進(jìn)行研究。結(jié)果顯示FVTFPYIR特異性最好。其次通過動力學(xué)模擬研究復(fù)合物體系的穩(wěn)定性，為此進(jìn)行5 ns的常規(guī)動力學(xué)模擬。在分子動力學(xué)模擬過程中，小分子配體在模擬起初階段RMSD上升較快，表明小分子比較靈活，在結(jié)合位點(diǎn)附近略顯波動，并能周期性形成氫鍵進(jìn)而使結(jié)合更加穩(wěn)定[18]；而后很快在0.15 nm左右波動 (除LVSFPYVR外)，受體蛋白同樣在起始階段RMSD上升較快，這主要是蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)優(yōu)化造成[19]，在0.25 nm和0.35 nm后我們也發(fā)現(xiàn)有兩條多肽的RMSD值發(fā)生突變 (圖4C，D)，極有可能碳骨架發(fā)生斷裂，不宜作為候選藥物。令人欣喜的是，反義肽FVTFPYIR與受體結(jié)合后，能在影響受體構(gòu)象穩(wěn)定的同時而保持自身的穩(wěn)定。

早有研究表明VEGF-C反義肽可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及抑制腫瘤組織VECFR-3陽性血管的形成，發(fā)揮抗骨肉瘤作用[20]。因此在以上工作的基礎(chǔ)上，我們也初步探究了本研究篩選獲得的反義肽對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。依據(jù)反義肽的特異性和動力學(xué)模擬結(jié)果，我們合成了評價(jià)最優(yōu)的反義肽FVTFPYIR，同時選取MT1-MMP表達(dá)的MG63、MDA-MB-231細(xì)胞和不表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、MCF7作為實(shí)驗(yàn)對象，結(jié)果表明該反義肽對MG6和MDA-MB-231細(xì)胞有很好的抑制作用，而對MDA-MB-453細(xì)胞幾乎是促進(jìn)生長，對MCF7細(xì)胞活力幾乎無劑量依賴抑制作用。有研究報(bào)道，人工合成的十九肽[21]或者通過噬菌體文庫篩選得到的短肽[22]能夠促進(jìn)軸突的生長，從另一角度佐證了我們合成的多肽在較低濃度下促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞生長的可能性。結(jié)合4種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測這很可能與細(xì)胞是否表達(dá)MT1-MMP有關(guān)，該結(jié)論也與動力學(xué)模擬結(jié)果相得益彰。進(jìn)一步的細(xì)胞親和力測定結(jié)果也證明了反義肽對MT1-MMP表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞的靶向結(jié)合能力。當(dāng)然，更可靠的結(jié)論將有待于在MT1-MMP蛋白表達(dá)、酶蛋白活性以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等水平的檢測與分析來進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述，本研究通過生物信息與計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法篩選與獲得了5條能與MT1-MMP有效對接的反義肽，體外實(shí)驗(yàn)初步確認(rèn)反義肽FVTFPYIR對MG63和MDA-MB-231細(xì)胞增殖有一定的抑制作用以及對后者的親和力。進(jìn)一步的多肽體外作用研究尚在進(jìn)行中。本研究也為靶向MT1-MMP抗腫瘤反義肽先導(dǎo)藥物的研發(fā)提供了一種新的思路與途徑。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Virtual screening and molecular simulations of antisense peptides targeting MT1-MMP

Li Zeng, Bowen Tan, Yalan Yang, Jinyi Qiu, Lili Xiong, and Canquan Mao

Laboratory of Molecular Evolution and Applied Biology, School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, Sichuan, China

Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP or MMP14) plays the pivotal role in tumor development and metastasis, so it is a promising drug target in malignancy. To acquire MT1-MMP specific binding peptides, we first analyzed MMPs sequences to find the divergent and specific sequence of MT1-MMP by bioinformatics approach, then set the specific sequence as the sense peptide target and designed antisense peptide library. Finally, by means of molecular docking, molecular dynamics simulation andcell assays, we screened the antisense peptide library against MT1-MMP and further studied the obtained specific peptides. Here, we identified the divergent and specific sequence of AYIREGHE (Named MT1-loop) located in MT1-MMP loop by multiple sequence alignment and established the antisense peptides library with capacity of 1 536 sequences. After two rounds of virtual screening, we obtained five antisense peptides with Rerankscores in the top for further screening. They all interacted with MT1-MMP, and docked well at the active site composed of MT1-loop sequence. Analysis of the affinities of these five antisense peptides to other MMPs (MMP1-3, MMP7-13, MMP14 HPX, MMP16) revealed that the peptide FVTFPYIR was more specific to MT1-MMP. Molecular dynamics simulation showed that the peptide FVTFPYIR might affect the stability of MT1-MMP and thus have effects on its activities. Meanwhile, the peptide FVTFPYIR could specifically inhibit the growth of MG63 and MDA-MB-231 tumor cells both of which expressed MT1-MMP. The work provides a new insight and way for the development of antitumor lead peptides targeting MT1-MMP.

membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP, MMP14), antisense peptide, molecular docking, molecular dynamics simulation

April 2, 2014; Accepted: May 7, 2014

Canquan Mao. Tel: +86-28-87634296; E-mail: maocq@swjtu.edu.cn

Supported by: the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No. SWJTU09ZT28), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA06Z353).

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專題研究項(xiàng)目 (No. SWJTU09ZT28)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2006AA06Z353) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-05-28

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140199.html