聚N-異丙基丙烯酰胺細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的研究進(jìn)展

楊磊，劉天慶，范曉光，王菲，李政

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聚N-異丙基丙烯酰胺細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的研究進(jìn)展

楊磊1，劉天慶2，范曉光3，王菲1，李政1

1 遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧撫順 113001 2 大連理工大學(xué)大連市干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧大連 116024 3 中國(guó)石油撫順石化分公司，遼寧撫順 113008

楊磊，劉天慶，范曉光，等. 聚N-異丙基丙烯酰胺細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 172-182.Yang L, Liu TQ, Fan XG, et al. Advances in poly (N-isopropylacrylamide) based platforms for cell culture. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 172-182.

聚N-異丙基丙烯酰胺 (poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)，溫敏性聚合物，可利用其溫敏特性替代酶類物質(zhì)或細(xì)胞刮刀用于貼壁細(xì)胞的收獲，從而有效避免酶解和機(jī)械損傷，可為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細(xì)胞。重點(diǎn)闡述促進(jìn)細(xì)胞有效粘附和快速脫附的溫敏性PNIPAAm二維平面的研發(fā)情況，包括選取特殊基材、引入親水基團(tuán)、調(diào)節(jié)反應(yīng)物比率、控制聚合物厚度/密度、提供適宜外力等方式，從而有效改善細(xì)胞對(duì)溫敏性平面的適應(yīng)性并降低染菌風(fēng)險(xiǎn)以及減少低溫處理對(duì)細(xì)胞的影響。同時(shí)介紹PNIPAAm微載體、支架和凝膠等溫敏性三維培養(yǎng)介質(zhì)的研究進(jìn)展，此方式不僅增加細(xì)胞生長(zhǎng)面積，更可以模擬體內(nèi)微環(huán)境，從而保持細(xì)胞原始生理特征，同時(shí)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增和非酶解收獲細(xì)胞以及組織器官修復(fù)和重構(gòu)的目標(biāo)。最后簡(jiǎn)單說(shuō)明PNIPAAm培養(yǎng)平臺(tái)的應(yīng)用，PNIPAAm的研發(fā)為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了嶄新思路。

聚N-異丙基丙烯酰胺，溫敏性聚合物，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，干細(xì)胞，細(xì)胞片層工程

在材料表面良好粘附對(duì)體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞十分重要，將影響其遷移、增殖、分化等生理活動(dòng)，同時(shí)從培養(yǎng)基底有效脫附也是細(xì)胞繁衍后代和維持性狀的必要過(guò)程。目前常用的細(xì)胞回收方式包括酶解法和機(jī)械法，但此二法均在某種程度損傷膜蛋白致使細(xì)胞功能缺失。為了向生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細(xì)胞，有必要采用非酶解非機(jī)械方式將細(xì)胞與培養(yǎng)表面分離。研究表明溫敏型聚合物PNIPAAm可有效替代傳統(tǒng)方法進(jìn)行細(xì)胞回收，主要利用其自身具有隨溫度變化而呈現(xiàn)表面和整體性質(zhì)轉(zhuǎn)換的特性來(lái)控制細(xì)胞粘附抑或脫附。采用此種收獲方式，細(xì)胞伴隨完整膜蛋白和粘附蛋白共同脫離，同時(shí)細(xì)胞間連接蛋白也未遭受破壞。因此，運(yùn)用PNIPAAm的降溫回收法與傳統(tǒng)收獲方法相比，能夠保持細(xì)胞更強(qiáng)的生長(zhǎng)特性或分化潛能。本文將綜述近年來(lái)以PNIPAAm為主體的溫敏性二維、三維細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的研發(fā)及應(yīng)用情況。

1 溫敏性PNIPAAm二維平面

20世紀(jì)90年代初，日本學(xué)者Okano團(tuán)隊(duì)[1]首次將PNIPAAm用于細(xì)胞培養(yǎng)和收獲過(guò)程。他們采用電子束照射的方式將NIPAAm單體聚合接枝于聚苯乙烯培養(yǎng)皿，使材料表面具有溫敏特性，當(dāng)溫度高于最低臨界溶液溫度 (Lower critical solution temperature, LCST) 時(shí)其表面呈現(xiàn)疏水性，而溫度降低時(shí)則轉(zhuǎn)化為親水性，接種于此智能表面的細(xì)胞僅通過(guò)變溫調(diào)節(jié)就可控制其粘附生長(zhǎng)或脫附回收。至此開創(chuàng)了溫敏性材料用于細(xì)胞培養(yǎng)的新紀(jì)元。我們采用自由基聚合法以NIPAAm、甲基丙烯酸羥丙酯 (HPM) 和甲基丙烯酸 (3-三甲氧基硅) 丙酯 (TMSPM) 為原料合成了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物，然后采用旋轉(zhuǎn)涂膜法和真空退火法在蓋玻片上形成共聚物膜，并且成功地將它們應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)和非酶解收獲過(guò)程[2-3]。

早期研究表明雖然溫敏性培養(yǎng)介質(zhì)可實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的自發(fā)脫附，但由于細(xì)胞完全覆蓋基底表面，使PNIPAAm類材料在降溫處理過(guò)程只能從邊緣向中心區(qū)域逐步發(fā)生水合作用，導(dǎo)致細(xì)胞完全脫附達(dá)數(shù)小時(shí)之久，這一方面增加了細(xì)胞染菌的風(fēng)險(xiǎn)，另一方面難以評(píng)估長(zhǎng)時(shí)間暴露于低溫環(huán)境對(duì)細(xì)胞造成的影響。因此，研究人員努力尋求促進(jìn)細(xì)胞有效粘附和快速脫附的溫敏性PNIPAAm二維平面。

1.1 選取特殊基材

將PNIPAAm接枝或涂覆于特殊基材表面，如親水性的聚合物層或通透性良好的多孔膜，可使降溫溶液在基材邊緣和底部同步滲透，加速PNIPAAm的水合作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的快速脫附。Akiyama等[4]在PNIPAAm與培養(yǎng)板之間引入親水性聚丙烯酰胺，降溫過(guò)程中間層的快速水合加速了細(xì)胞或細(xì)胞片層的脫附速率。Kwon等[5]采用聚 (對(duì)苯二甲酸乙二醇酯) 多孔膜作為PNIPAAm接枝的基底材料，結(jié)果表明無(wú)論分散細(xì)胞還是細(xì)胞片層從溫敏性多孔膜完全脫附的時(shí)間均少于從純PNIPAAm表面分離的時(shí)間。Oh等[6]將PNIPAAm接枝于聚苯乙烯納米纖維墊，結(jié)果表明人成纖維細(xì)胞在其上的脫附速率遠(yuǎn)大于在PNIPAAm接枝聚苯乙烯培養(yǎng)皿的速率。

1.2 引入親水基團(tuán)

親水性物質(zhì)的加入可促使溫敏性材料降溫過(guò)程的快速水合從而減少細(xì)胞完全脫附的時(shí)間，同時(shí)引入親水鏈段會(huì)提升溫敏性聚合物的LSCT，因此無(wú)需過(guò)度降溫就可達(dá)到優(yōu)越的細(xì)胞脫附效果。Ebara等[7]在PNIPAAm合成過(guò)程引入2-羧基異丙基丙烯酰胺，用于牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的快速脫附，結(jié)果顯示在20 ℃絕大部分細(xì)胞在60 min內(nèi)從共聚物表面脫離，而粘附在純PNIPAAm表面上的細(xì)胞僅處于起始脫附階段。Liu等[8]考察L929細(xì)胞在PNIPAAm-聚乙二醇 (PEG) 納米復(fù)合水凝膠上的生長(zhǎng)和脫附情況，結(jié)果表明細(xì)胞在溫敏性水凝膠上增殖狀態(tài)良好并未受到親水組分的影響，且在降溫處理時(shí)展現(xiàn)快速的脫附能力。Kim等[9]將高度吸濕性聚合物聚 (2-羥乙基甲基丙烯酸酯) (PHEMA) 和PNIPAAm共同接枝于細(xì)胞培養(yǎng)板，并與常規(guī)PNIPAAm接枝培養(yǎng)板比較，結(jié)果表明細(xì)胞從PHEMA-PNIPAAm接枝培養(yǎng)板全部脫附時(shí)間僅為13 min，而對(duì)照組則需75 min。Wang等[10]將NIPAAm、丙烯酸和殼聚糖合成新型的溫敏性凝膠，殼聚糖的加入可促進(jìn)細(xì)胞粘附，而丙烯酸的引入則加快細(xì)胞的脫附速率。上述結(jié)果證實(shí)溫敏性終產(chǎn)物中的羥基、羧基、酯基等基團(tuán)確為細(xì)胞的快速脫附提供了良好的親水環(huán)境。我們同樣在聚合物制備過(guò)程引入親水性HPM成分，結(jié)果表明不同類型細(xì)胞均可在10 min內(nèi)從各自適宜的P(NIPAAm-co-HPM-co- TMSPM) 共聚物膜完全脫附。

1.3 調(diào)節(jié)反應(yīng)物比率

生物材料的化學(xué)組成會(huì)影響其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，如表面潤(rùn)濕性、粗糙度、溶脹性能、機(jī)械強(qiáng)度等，從而波及細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)。PNIPAAm與功能成分 (如親水性、促粘附、帶電荷物質(zhì)等) 之間的比例，以及材料整體呈現(xiàn)的電荷極性、密度和LCST等參數(shù)均會(huì)影響細(xì)胞的粘附和脫附，所以需要通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳反應(yīng)物混合比率。Ohya等[11]制備具有不同接枝密度的PNIPAAm-明膠水凝膠，用于確定最佳反應(yīng)物混合比率 (P/G)。人臍帶血靜脈上皮細(xì)胞可粘附和鋪展于具有較高P/G的水凝膠，因?yàn)榇怂z表面更為粗糙且具備較高的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)互穿微孔可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散。Kong等[12]考察PNIPAAm與親水性[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨內(nèi)鹽的比例對(duì)NIH3T3細(xì)胞粘附和脫附的影響，結(jié)果證明最優(yōu)反應(yīng)物配比為75∶1。Liu等[13]將NIPAAm和帶電單體合成納米復(fù)合凝膠。結(jié)果表明L929細(xì)胞的增殖與電荷極性和密度相關(guān)，含有小于5%甲基丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯的陽(yáng)離子凝膠可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而含有2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸鈉的陰離子凝膠相對(duì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；降溫處理后，細(xì)胞可從含有1%離子單體的復(fù)合凝膠快速脫附，但更高單體含量制備的表面卻不再支持細(xì)胞的快速脫附，這可能是溶脹效果不佳或靜電吸引增強(qiáng)所致。

我們研究的最終目的是制備溫敏性聚合物膜，實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞在其上的粘附和降溫脫附。選用聚合-涂覆二步成膜方案，合成的終產(chǎn)物作為聚合物膜的前體，其組分的選擇和比例的控制都要利于溫敏性聚合物膜的制備和性能的調(diào)節(jié)。分別選取NIPAAm、TMSPM和HPM三種雙鍵類單體，采用自由基聚合法將三者合成新型的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物。圖1展示了共聚物分子結(jié)構(gòu)中的功能基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)[14]。

NIPAAm作為主體反應(yīng)物，在終產(chǎn)物中占用足夠比例，可有效維持PNIPAAm的溫敏特性，酰胺鍵和異丙基鍵作為共聚物膜的功能基團(tuán) (實(shí)線標(biāo)注)，用以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在其上的有效粘附和降溫脫附，所以選取90%的摩爾比例。TMSPM作為硅烷交聯(lián)劑，在共聚物合成過(guò)程相對(duì)穩(wěn)定，但在高熱或輻照條件下可創(chuàng)建共聚物與含有羥基基團(tuán)的鏈接，TMSPM的添加量一般為5%。HPM組分可為共聚物分子鏈間的鍵合提供羥基。硅氧烷鍵和羥基作為共聚物中的反應(yīng)基團(tuán) (虛線標(biāo)注)，在共聚物膜形成過(guò)程中，TMSPM既可與基底的羥基發(fā)生脫甲醇反應(yīng)，又可與自身或其他分子鏈的羥基產(chǎn)生鍵合，從而實(shí)現(xiàn)共聚物與共聚物之間，共聚物與基底之間的同時(shí)鏈接。此外，親水性HPM的添加利于共聚物膜在降溫過(guò)程的快速水合，從而加速細(xì)胞的脫附速率，但過(guò)多添加HPM，培養(yǎng)表面過(guò)強(qiáng)的親水性則不利于細(xì)胞粘附，所以選用適宜的添加量5%，即完成共聚物與共聚物之間，共聚物與基底之間的同時(shí)鏈接即可。綜上，NIPAAm、TMSPM和HPM的摩爾比為18∶1∶1。后續(xù)結(jié)果表明采用此比例制備的P(NIPAAm-co-HPM-co- TMSPM) 共聚物膜具有良好的溫敏性、穩(wěn)定性、可控性及快速響應(yīng)性等，且可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)與收獲。

圖1 P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物分子結(jié)構(gòu)的功能基團(tuán)(實(shí)線)和反應(yīng)基團(tuán)(虛線)[14]

1.4 控制聚合物厚度/密度

盡管經(jīng)由等離子體處理獲得的PNIPAAm表面，細(xì)胞附著不受其聚合物厚度/密度的制約，但采用電子束或紫外線照射、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合以及可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合等方式制取的PNIPAAm基底，其聚合物厚度/密度則會(huì)影響細(xì)胞的粘附和脫附。Li等[15]制備具有厚度梯度的PNIPAAm膜層，結(jié)果表明具有20-45 nm厚度的溫敏性膜適宜HepG2細(xì)胞在37 ℃粘附和24 ℃脫附。Takahashi等[16]采用調(diào)節(jié)鏈轉(zhuǎn)移劑二硫代酯的濃度和可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合技術(shù)調(diào)控PNIPAAm接枝鏈的分子量和密度，他們指出接枝鏈的長(zhǎng)度和密度顯著影響細(xì)胞的粘附和脫附行為，并且應(yīng)用上述技術(shù)可為不同細(xì)胞篩選合適的溫敏性平面。Nash等[17]采用旋轉(zhuǎn)涂覆和紫外照射的方式制備PNIPAAm凝膠涂層，結(jié)果顯示3T3細(xì)胞只在厚度小于30 nm的涂層粘附和增殖，且細(xì)胞片層可在降溫10 min 后完全脫附。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)不同種類細(xì)胞對(duì)P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物膜具有各異的選擇性，并根據(jù)同時(shí)滿足促進(jìn)細(xì)胞粘附和減少細(xì)胞脫附時(shí)間的原則，可為不同種類細(xì)胞選擇適宜的溫敏性培養(yǎng)基底。

綜上，由于制備方法、組成成分的差異，適宜不同細(xì)胞的PNIPAAm基底的聚合物厚度/密度 (T/D) 有所不同，但均呈下述規(guī)律，如 圖2所示。當(dāng)T/D較小時(shí)，細(xì)胞能夠粘附和生長(zhǎng)于PNIPAAm基底，但其表面潤(rùn)濕性和溶脹性能隨降溫變化的幅度較小，不足以提供足夠的驅(qū)動(dòng)力使細(xì)胞脫附；當(dāng)T/D增至一定范圍，此溫敏性表面在生理?xiàng)l件下適合細(xì)胞粘附和增殖，而經(jīng)過(guò)降溫處理其性質(zhì)改變的程度足以使細(xì)胞與表面脫離，可通過(guò)后續(xù)細(xì)胞鑒定實(shí)驗(yàn)篩選出適宜的培養(yǎng)介質(zhì)；當(dāng)T/D繼續(xù)增加，溫敏性表面由于較強(qiáng)的水合作用而不再支持細(xì)胞粘附，細(xì)胞由于失去粘附位點(diǎn)而懸浮于培養(yǎng)基，最終凋亡甚至死亡。

圖2 降溫前后細(xì)胞在不同厚度和表面潤(rùn)濕性的溫敏性基底的粘附和脫附情況

1.5 提供適宜外力

降溫處理時(shí)，為減少直接置于低溫環(huán)境培養(yǎng)基自然冷卻時(shí)間且避免細(xì)胞再次粘附，通常采用低溫?zé)o血清培養(yǎng)基作為冷卻介質(zhì)。冷鮮培養(yǎng)基的人工注入可為細(xì)胞脫附的啟動(dòng)提供外在驅(qū)動(dòng)力，使PNIPAAm基底邊緣區(qū)域迅速變厚且更具親水性，細(xì)胞與基底之間的平衡瞬間破壞。處于邊緣的細(xì)胞變圓隨即脫附，為培養(yǎng)基持續(xù)進(jìn)入細(xì)胞-基底界面提供有效空間，從而導(dǎo)致細(xì)胞連續(xù)脫附。除手動(dòng)提供驅(qū)動(dòng)力外，自動(dòng)化供力方式具備可控性、重復(fù)性、再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，更為可取。Tang等[18]在具有平行通道的PNIPAAm接枝培養(yǎng)板上鍵合聚二甲基硅氧烷薄片從而構(gòu)建封閉的細(xì)胞培養(yǎng)空間，以保證各組細(xì)胞處于相同培養(yǎng)環(huán)境，而當(dāng)降溫細(xì)胞脫離時(shí)又可提供不同的剪切力，結(jié)果證實(shí)外力的介入有助于細(xì)胞的快速脫附。

綜上，目前促進(jìn)細(xì)胞有效粘附和快速脫附的方法仍以溫敏性表面物理性質(zhì)的改造為主，而關(guān)于化學(xué)性質(zhì)的改造以及兩種性質(zhì)的結(jié)合仍待于深入研究。并且通過(guò)現(xiàn)有研究?jī)?nèi)容，難以確定影響細(xì)胞行為各種參數(shù)的重要程度以及彼此之間的最佳組合。

2 溫敏性PNIPAAm三維介質(zhì)

PNIPAAm及其衍生物介導(dǎo)的溫敏性二維培養(yǎng)平面的研究已初具成效，但仍存在難以模擬細(xì)胞天然生長(zhǎng)狀態(tài)、材料制備和細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)繁瑣，細(xì)胞產(chǎn)量微小等局限性，而三維培養(yǎng)模式既可保留體內(nèi)微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及可控性，同時(shí)便于將體外細(xì)胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究有機(jī)結(jié)合。因此，研究人員逐步嘗試將PNIPAAm引入微載體、支架或凝膠等體系從而形成溫敏性三維介質(zhì)，用于貼壁細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增和非酶解收獲以及組織器官的修復(fù)或重構(gòu)等。我們?cè)赑NIPAAm合成過(guò)程引入HPM和TMSPM，可實(shí)現(xiàn)P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM) 共聚物與任何形狀和尺寸的含羥基材質(zhì)的耦合，如果將該溫敏性共聚物膜制備于微載體或中空纖維膜上，再結(jié)合生物反應(yīng)器技術(shù)，則有望形成新的體外大規(guī)模擴(kuò)增細(xì)胞的培養(yǎng)體系，這亦是我們下一階段的研究重點(diǎn)。

2.1 PNIPAAm微載體

采用溫敏性微載體或支架培養(yǎng)細(xì)胞是目前模擬體內(nèi)空間微環(huán)境的最佳方案，如圖3所示。這種模式有利于細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子相互作用，從而保持細(xì)胞原始生理特征，并且由于增加細(xì)胞生長(zhǎng)面積以及引入溫敏性PNIPAAm可在短時(shí)間、小空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增和非酶解收獲細(xì)胞的目標(biāo)。

Yang等[19]將PNIPAAm接枝于Cytodex-3(R) 微載體，并結(jié)合生物反應(yīng)器考查大規(guī)模擴(kuò)增Vero細(xì)胞的可行性，結(jié)果表明Vero細(xì)胞可在此溫敏性微載體上粘附、鋪展和生長(zhǎng)，同時(shí)降溫處理后細(xì)胞可發(fā)生自發(fā)脫附，從而有效避免酶解損失同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增細(xì)胞的目標(biāo)。Tamura等[20]通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方式將PNIPAAm接枝于氯甲基化聚苯乙烯微球表面，結(jié)果表明在37 ℃，CHO-K1細(xì)胞可附著于溫敏性微球，而當(dāng)溫度降至20 ℃，細(xì)胞可發(fā)生自發(fā)脫附，并且細(xì)胞脫附率隨PNIPAAm接枝量的增加以及微球直徑的增大而增加。Park等[21]借助超支化聚硅氧烷將PNIPAAm固定于二氧化硅微球表面，并闡明具有高分子量PNIPAAm的溫敏性微球可用于控制細(xì)胞的粘附和脫附。Cetinkaya 等[22]指出盡管胎牛軟骨細(xì)胞在自制PHEMA-PNIPAAm微球上的粘附效率和增殖能力略低于在商品化Cytodex-1和Biosilon微載體的培養(yǎng)結(jié)果，但通過(guò)降溫處理從溫敏性微球分離的細(xì)胞依然具有正常增殖活性。Wu等[23]構(gòu)建了乳糖基化PNIPAAm-PEG微球，HepG2細(xì)胞在此溫敏性微球內(nèi)成球生長(zhǎng)并展現(xiàn)較高的肝臟分泌水平，降溫后微球液化可輕易獲取肝細(xì)胞球狀體。

圖3 用于細(xì)胞培養(yǎng)和收獲的溫敏性微載體和支架Fig. 3 Thermoresponsive microcarrier and scaffold for cell culture and recovery.

2.2 PNIPAAm支架

采用微球模板、低溫冷凍和靜電紡絲等方式可制備具有特定構(gòu)造和溫敏特性的PNIPAAm支架。Galperin等[24]結(jié)合紫外照射和微球模板等方式將PNIPAAm、2-亞甲基-1,3-二氧雜環(huán)庚烷和聚已內(nèi)酯甲基丙烯酸二酯合成為可降解、孔徑均一且可調(diào)控的溫敏性支架。結(jié)果證實(shí)具有(55±5) μm孔徑的支架適合NIH3T3細(xì)胞的接種且保證細(xì)胞在37 ℃時(shí)無(wú)法脫出，同時(shí)細(xì)胞在支架內(nèi)展現(xiàn)良好的信號(hào)傳遞和鋪展?fàn)顟B(tài)。Peniche等[25]在低溫條件下采用自由基聚合的方式制備附載殼聚糖和貝米肝素納米顆粒的PNIPAAm大孔支架。這種冷凍支架對(duì)人成纖維細(xì)胞無(wú)毒，且可控制肝素的釋放。Tiwari等[26]采用耦合化學(xué)和靜電紡絲的方式構(gòu)建以PNIPAAm-碳納米管-聚苯胺為主體的無(wú)紡布纖維組構(gòu)支架，與商品化Matrigel相比，L929細(xì)胞在該組構(gòu)支架上展現(xiàn)極好的增殖能力和活性，溫度降至LCST以下時(shí)細(xì)胞可自發(fā)脫附。

2.3 PNIPAAm凝膠

PNIPAAm均聚物和共聚物凝膠具備如下優(yōu)點(diǎn)：允許細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)且使細(xì)胞錨定在材料內(nèi)部，可根據(jù)生理環(huán)境調(diào)整自身形狀，適合傳遞和輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，可通過(guò)調(diào)整其組成來(lái)控制凝膠的相轉(zhuǎn)變點(diǎn)等。將細(xì)胞包埋于PNIPAAm介導(dǎo)的凝膠內(nèi)，結(jié)果證實(shí)溫敏性凝膠具有良好的生物相容性，細(xì)胞可在其內(nèi)部粘附和鋪展，培養(yǎng)一定時(shí)期仍呈較高的生長(zhǎng)活性，并保持較強(qiáng)的生理功能。Lu等[27]將MIN6細(xì)胞包埋于PNIPAAm-聚乙二醇-PNIPAAm微凝膠內(nèi)，結(jié)果表明此溫敏性水凝膠具有良好的生物相容性，5 d后MIN6細(xì)胞在微凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)較高的生長(zhǎng)活性并形成小型團(tuán)聚物且保持較強(qiáng)的胰島素分泌能力。Gan等[28]采用自由基沉淀聚合法制備PNIPAAm-甲基丙烯酸羥乙酯微凝膠，具有互聯(lián)多孔結(jié)構(gòu)，且其孔徑隨脫水收縮作用的增強(qiáng)而逐漸變小，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞在脫水收縮作用較低的微凝膠內(nèi)，展現(xiàn)較強(qiáng)的增殖和成球生長(zhǎng)能力，但在收縮作用較高的微凝膠內(nèi)其生長(zhǎng)受到抑制。Sa-Lima等[29]考察了PNIPAAm-甲基纖維素水凝膠作為軟骨細(xì)胞微囊化三維介質(zhì)的可行性，結(jié)果表明微囊化的ATDC5細(xì)胞依然保持較高的活性和增殖能力。Chen等[30]將透明質(zhì)酸、殼聚糖和PNIPAAm合成可注射性溫敏性水凝膠，同時(shí)嵌入雙相磷酸鈣陶瓷顆粒，用于工程仿生骨的構(gòu)建。

綜上，就生長(zhǎng)區(qū)域而言，細(xì)胞分別生長(zhǎng)在PNIPAAm微載體的表面和支架或凝膠的內(nèi)部；就最終目的而言，凝膠主要用于組織工程，通常不涉及細(xì)胞收獲問題，添加PNIPAAm的原因主要是利用其隨溫度改變的體積相變化進(jìn)而將種子細(xì)胞隨凝膠共同注入活體的受損部位，用于組織或器官的修復(fù)或重構(gòu)；而應(yīng)用微載體和支架則以體外大規(guī)模擴(kuò)增細(xì)胞為目標(biāo)，添加PNIPAAm的目的主要是利用其隨溫度改變的表面潤(rùn)濕性和整體厚度變化從而進(jìn)行細(xì)胞的無(wú)侵害性收獲。

3 溫敏性PNIPAAm培養(yǎng)平臺(tái)的應(yīng)用

根據(jù)PNIPAAm平臺(tái)的類型和后續(xù)操作方案的不同，可將細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果分為下述4種 情況：

1) 將貼壁型細(xì)胞接種于PNIPAAm二維或三維表面，如果接種密度較低或培養(yǎng)時(shí)間較短，盡管細(xì)胞不斷分泌細(xì)胞外基質(zhì) (Extracellular matrix, ECM)，但無(wú)法完全融合，所以降溫處理并輕微吹打后，細(xì)胞展現(xiàn)單獨(dú)分散狀態(tài)，但伴隨膜蛋白和粘附蛋白共同脫附[5,7,31]，如圖4A所示。這一方面利于細(xì)胞再次接種的快速定位，另一方面由于對(duì)細(xì)胞膜的有效保護(hù)從而利于細(xì)胞原始特性的維持。

2) 將貼壁型細(xì)胞接種于PNIPAAm二維或三維表面，如果接種密度較高或培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，除大量分泌ECM外，細(xì)胞的增殖和通訊可使細(xì)胞間形成連接蛋白，從而生成融合的細(xì)胞片層，經(jīng)由降溫處理，細(xì)胞會(huì)以完整片層形式從培養(yǎng)表面脫離，即細(xì)胞膜蛋白、粘附蛋白和連接蛋白均被完好的保留并隨細(xì)胞共同脫附[5,7,31]，如圖4B所示。但存在例外，如果在PNIPAAm中引入過(guò)多陽(yáng)離子型物質(zhì)，那么在降溫過(guò)程細(xì)胞與溫敏性材料之間的靜電引力便會(huì)大于引起細(xì)胞自身脫附的骨架張力，因此細(xì)胞片層不能完整從材料表面剝離，反而在細(xì)胞骨架張力的作用下使細(xì)胞連接受到破壞[13]。

3) 將細(xì)胞包埋于PNIPAAm支架或凝膠內(nèi)部，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞在孔道中相繼完成粘附、鋪展、生長(zhǎng)和增殖等系列生理活動(dòng)，但同一孔道容納細(xì)胞數(shù)量有限。降溫處理使孔道尺寸擴(kuò)大或主體解離，促使細(xì)胞釋放，經(jīng)輕微吹打，細(xì)胞可呈離散狀態(tài)[24]。

4) 將細(xì)胞包埋于PNIPAAm支架或凝膠內(nèi)部，主要針對(duì)組織工程背景進(jìn)行研究，重點(diǎn)考查細(xì)胞在材料內(nèi)部的增殖分化及組織形成能力[27-30]，通常不涉及將細(xì)胞從支架或凝膠中取出的過(guò)程。

綜上，方案1) 和3) 可獲取單獨(dú)分散細(xì)胞，利于細(xì)胞繼續(xù)接種或性能檢測(cè)，且避免酶解損傷從而有效維持細(xì)胞的原始特征，所以其最終目的是大規(guī)模擴(kuò)增細(xì)胞。特別對(duì)于培養(yǎng)敏感細(xì)胞或需要維持高水平的細(xì)胞活力抑或控制細(xì)胞的分化程度，此培養(yǎng)方案尤為適用，如干細(xì)胞等。研究表明，作為智能型培養(yǎng)基底，PNIPAAm表面在37 ℃時(shí)可支持干細(xì)胞的粘附、鋪展、遷移、生長(zhǎng)、增殖和分化，且經(jīng)過(guò)降溫收獲后的干細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能及較高活性和較完整的免疫表型，可為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供品質(zhì)優(yōu)良的種子細(xì)胞[32-35]。

圖4 降溫前后分散細(xì)胞和細(xì)胞片層在溫敏性表面的粘附和脫附情況

如上所述，方案4) 主要應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。由于方案2) 可形成完整的富含多種關(guān)鍵蛋白的細(xì)胞片層，因此衍生出新的組織工程方向——細(xì)胞片層工程 (Cell sheet engineering)[36-38]。降溫收獲的細(xì)胞片層可用于組織構(gòu)建，即將細(xì)胞片層進(jìn)行逐層疊加，其中單層細(xì)胞片層可用于皮膚和角膜的重構(gòu)，相同的細(xì)胞片層疊加可用于心臟的重構(gòu)，圖案化的細(xì)胞片層疊加可用于肝和腎組織的重構(gòu)，而形狀化的細(xì)胞片層可用于血管、腎小管等組織的重構(gòu)[39]。

因此，需要根據(jù)最終應(yīng)用來(lái)選擇適宜的溫敏性PNIPAAm培養(yǎng)平臺(tái)，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增具有原始特征的重要細(xì)胞或達(dá)到組織器官修復(fù)和重構(gòu)的目標(biāo)。

4 結(jié)論與展望

以溫敏性材料PNIPAAm為培養(yǎng)介質(zhì)，以與之匹配的降溫脫附法作為收獲方式的細(xì)胞培養(yǎng)和回收體系持續(xù)受到廣泛關(guān)注。研究人員一直致力于新型PNIPAAm培養(yǎng)平臺(tái)的研發(fā)以及多種細(xì)胞類型的嘗試。但可通過(guò)以下途徑加以改進(jìn)：1) 開發(fā)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的制備工藝，便于PNIPAAm在細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用；2) 引入無(wú)毒無(wú)害的功能原/輔料，增強(qiáng)PNIPAAm介質(zhì)的快速響應(yīng)性、反復(fù)使用性和生物相容性；3) 探討影響細(xì)胞行為各種參數(shù)的重要程度及彼此之間的最佳組合，促進(jìn)細(xì)胞有效粘附和快速脫附。4) 將溫敏性材料與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增和組織重構(gòu)的目標(biāo)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Advances in poly (N-isopropylacrylamide) based platforms for cell culture

Lei Yang1, Tianqing Liu2, Xiaoguang Fan3, Fei Wang1, and Zheng Li1

1 School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113001, Liaoning, China 2 Dalian R&D Center for Stem Cell and Tissue Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China 3 Fushun Petrochemical Company, China National Petroleum Corporation, Fushun 113008, Liaoning, China

Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), a temperature-responsive polymer, can be potentially applied to replace enzymes or cell scrapers to recover attached cells. Taking full advantage of this unique function of PNIPAAm, cells can be protected from enzymatic hydrolysis and mechanical treatment, thereby to provide ideal seed cells with high quality for biomedical fields. In this review we describe the method to facilitate cell effective adhesion and rapid detachment on thermoresponsive two dimensional surfaces, including selecting special substrate, introducing hydrophilic group, adjusting reactant ratio, controlling polymer thickness/density, providing appropriate external force, so as to effectively improve adherent cell adaptability to thermoresponsive surfaces, depress the risk of bacterial contamination and reduce the effect of low-temperature treatment on the cells. The three dimensional cell culture systems involved in temperature-sensitive microcarriers, scaffolds and gels were briefly discussed. The application based on the platforms for cell culture was also presented.

poly (N-isopropylacrylamide), temperature-responsive polymer, cell culture substrate, stem cell, cell sheet engineering

April 14, 2014; Accepted: September 1, 2014

Lei Yang. Tel: +86-24-56861705; E-mail: leiyang1982@yahoo.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31170945).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31170945) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-09-24

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140226.html