大劑量大黃素致大鼠肝損傷及其機(jī)制的初步研究*

張斌，丁慎華，錢雪梅，朱薇珊

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院肝病科，上海201700）

大劑量大黃素致大鼠肝損傷及其機(jī)制的初步研究*

張斌，丁慎華，錢雪梅，朱薇珊

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院肝病科，上海201700）

目的初步研究大黃素致藥物性肝損傷（DILI）大鼠模型氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及肝臟病理的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。方法Wistar雄性大鼠按每天大黃素?cái)z入量不同，分為高劑量組、較高劑量組、中劑量組、低劑量組、溶劑對(duì)照組及正常組，于4、8和12周分別觀察肝脾指數(shù)、肝組織蘇木精-伊紅染色法（HE）染色、肝組織丙二醛（MDA）及單胺氧化酶（MAO）的水平。結(jié)果各組生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯區(qū)別，無死亡和腹水形成。高劑量組和較高劑量組的肝脾指數(shù)、肝組織MAO及MDA含量有升高趨勢(shì)，第8周后肝組織炎癥活動(dòng)明顯，其中高劑量組變化更明顯。結(jié)論大劑量大黃素可以造成大鼠肝損傷，其損傷可能與機(jī)體氧化應(yīng)激有關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。

藥物性肝損傷；大黃素；病理；氧化應(yīng)激

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指患者在其他疾病治療過程中由于藥物或其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所致的肝細(xì)胞毒性損害，或者肝臟對(duì)藥物及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的過敏反應(yīng)所導(dǎo)致的肝臟疾病，也稱作藥物性肝炎。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，DILI已上升至全球死亡原因的第5位，尤其中藥引起的肝損傷在臨床上越來越常見，應(yīng)引起人們的高度重視[1-3]。近年來，何首烏由于具有降血脂、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用受到許多人的青睞，但因此造成的藥物性肝損傷也時(shí)有報(bào)道[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃素是何首烏中主要的蒽醌化合物，具有抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用，是造成DILI的原因之一[5-6]。從大黃素入手探視其藥物性肝損傷的機(jī)制顯得非常必要，為此本研究選擇大鼠作為研究對(duì)象，采用不同劑量大黃素進(jìn)行灌胃，對(duì)其肝病理及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

大黃素購自南京中藥研究所，與羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，按高、較高、中、低劑量組分別配制成1.6、0.8、0.4和0.2 mg/ml濃度的液體，4℃下保存?zhèn)溆?。單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠120只，清潔級(jí)，體重（100±10）g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，所有大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.3方法

1.3.1 大鼠肝癌模型制備及標(biāo)本留取將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成6組，根據(jù)人臨床用量，結(jié)合人和動(dòng)物間藥物劑量換算法，將劑量設(shè)置為高劑量組[16 mg/（kg·d）]、較高劑量組[8 mg/（kg·d）]、中劑量組[4 mg/（kg·d）]、低劑量組[2 mg/（kg·d）]、溶劑對(duì)照組（灌胃等體積的溶劑）及正常組（灌胃等體積蒸餾水），每組20只。第4和8周各組分別解剖5只大鼠，第12周解剖剩余大鼠（統(tǒng)計(jì)時(shí)各組隨機(jī)選5只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較）。大體觀察肝臟，記錄肝臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地，記錄大鼠一般情況。測(cè)量體重、肝重和脾重，血清保存于-80℃冰箱冷凍備用。按照下列公式計(jì)算肝脾指數(shù)：肝指數(shù)=肝質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（kg）×100％。脾指數(shù)=脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（kg）×100％。

1.3.2肝臟蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色常規(guī)制備肝組織切片，取各組大鼠肝組織進(jìn)行冷凍切片（8μm），以備染色。分別以HE滴染切片，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明后以中性樹膠封片。染色后的切片置于萊卡顯微鏡，分別以普通光和熒光進(jìn)行攝影和記錄。

1.3.3 肝組織MAO和MDA的測(cè)定肝組織勻漿制備，稱取100 mg大鼠肝臟加入600 L勻漿緩沖液（0.25 mol/L蔗糖溶液、0.1％Tween-20，5 mmol/L 3-巰基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟），在冰浴中勻漿。肝勻漿9 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。采用分光光度法測(cè)定MAO、MDA的活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況及肝脾指數(shù)

各組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯區(qū)別，其中較高劑量組和高劑量組活動(dòng)少，精神略萎靡，各組無死亡和腹水形成。第4周各組肝指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第8和12周時(shí)，較高劑量組和高劑量組肝指數(shù)有升高趨勢(shì)（P8周=0.157和0.001，P12周=0.002和0.000），尤其是高劑量組明顯升高，第12周時(shí)達(dá)最高（見表1）。第8和12周時(shí)，較高劑量組和高劑量組的脾指數(shù)有升高趨勢(shì)（P8周=0.003和0.004，P12周=0.001和0.000），尤其是高劑量組脾指數(shù)明顯升高，而溶劑組和正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

2.2病理組織學(xué)檢查

肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)，第4周各組比較無明顯區(qū)別。第8和12周時(shí)，較高劑量組和高劑量組肝組織的肝細(xì)胞變性明顯，偶見點(diǎn)狀壞死，有再生肝細(xì)胞，匯管區(qū)有少數(shù)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是高劑量組更明顯。其中12周較8周更加顯著。見附圖。

表1 各組肝指數(shù)比較（n=5，g/kg±s）

表1 各組肝指數(shù)比較（n=5，g/kg±s）

注：1）與高劑量組比較，P＜0.01；2）與高劑量組比較，P＜0.05；3）與正常組比較，P＜0.05；4）與正常組比較，P＜0.01

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表2 各組脾指數(shù)比較（n=5，g/kgs）

表2 各組脾指數(shù)比較（n=5，g/kgs）

注：1）與高劑量組比較，P＜0.01；2）與高劑量組比較，P＜0.05；3）與正常組比較，P＜0.05；4）與正常組比較P＜0.01

組別4周8周12周正常組2.55±0.262.72±0.181）2.68±0.191）溶劑對(duì)照組2.64±0.192.74±0.211）2.62±0.231）低劑量組2.54±0.252.85±0.161）2.87±0.421）中劑量組2.71±0.192.98±0.142）3.12±0.261）3）較高劑量組2.69±0.113.13±0.123）3.22±0.102）3）高劑量組2.77±0.163.32±0.284）3.69±0.314）

2.3肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的比較

研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量組和高劑量組肝組織MAO、MDA隨服藥時(shí)間延長(zhǎng)有逐步升高的趨勢(shì)（P8周MAO=0.001和0.000，P12周MAO=0.000和0.000；P8周MDA=0.003和0.003，P12周MDA=0.000和0.000），尤其是高劑量組更明顯，第12周時(shí)達(dá)高峰。見表3、4。

表3 各組大鼠肝組織MAO比較（n=5，u/mg±s）

表3 各組大鼠肝組織MAO比較（n=5，u/mg±s）

注：1）與高劑量組比較，P＜0.01；2）與正常組比較，P＜0.05；3）與正常組比較，P＜0.01；4）與高劑量組比較，P＜0.05

組別4周8周12周正常組28.46±1.481）29.40±1.721）30.94±3.311）溶劑對(duì)照組29.24±2.321）30.01±3.341）33.50±3.031）低劑量組30.22±2.171）34.97±2.291）2）32.07±1.591）中劑量組31.72±1.571）38.37±1.641）3）38.85±2.351）3）較高劑量組33.98±3.962）4）40.92±4.523）4）43.61±2.933）高劑量組37.55±2.133）44.97±3.343）47.22±5.243）

表4 各組大鼠肝組織MDA比較（n=5，nmol/mg±s）

表4 各組大鼠肝組織MDA比較（n=5，nmol/mg±s）

注：1）與高劑量組比較，P＜0.05；2）與高劑量組比較，P＜0.01；3）與正常組比較，P＜0.05；4）與正常組比較，P＜0.01

組別4周8周12周正常組7.49±2.321）9.04±1.712）8.73±1.952）溶劑對(duì)照組8.26±1.649.90±2.372）9.18±2.082）低劑量組9.00±2.8710.44±2.652）13.27±2.652）3）中劑量組9.83±3.4712.52±3.221）17.20±2.032）4）較高劑量組11.91±3.2115.47±2.943）21.36±2.394）高劑量組13.39±3.313）17.55±4.134）23.77±2.724）

3 討論

隨著中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合研究的發(fā)展，中藥制劑在我國(guó)的臨床應(yīng)用越來越廣泛。何首烏具有解毒、消癰、潤(rùn)腸的功效，而制何首烏主要用于補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨。自古以來何首烏是常用補(bǔ)藥，更是治療須發(fā)早白的良藥，人們認(rèn)為其是延年益壽之品，常年服用，但因此導(dǎo)致的藥物性肝損傷常被忽視。人們通常認(rèn)為西藥會(huì)導(dǎo)致較大的副作用，而中藥十分安全，不存在副作用。實(shí)際上，與西藥比較，中草藥較溫和，用藥時(shí)往往不太注意劑量和用法。但是，是藥三分毒，中藥和西藥一樣，也有毒副作用。何首烏的主要化學(xué)成分包括二苯乙烯類、蒽醌類和磷脂類等化學(xué)物質(zhì)，可起調(diào)節(jié)血脂、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和增加機(jī)體免疫力的作用。其中何首烏所含蒽醌類物質(zhì)大黃素是引起肝損傷的主要成分之一[4-9]。本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠作為研究對(duì)象，采用大黃素進(jìn)行灌胃，對(duì)其肝功能動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行初步研究。各組肝脾指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，較高劑量組和高劑量組的肝脾指數(shù)有升高趨勢(shì)，尤其是高劑量組脾指數(shù)升高更明顯。肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)，第8和12周時(shí)，較高劑量組和高劑量組肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞變性明顯，偶見點(diǎn)狀壞死，有再生肝細(xì)胞，匯管區(qū)有少數(shù)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其高劑量組明顯。上述研究表明，大黃素隨著服用劑量的增加和服用時(shí)間的延長(zhǎng)可以造成肝損傷，應(yīng)該引起重視。

目前，普遍認(rèn)為中藥引起肝損傷涉及很多損傷機(jī)制，主要為細(xì)胞色素P450、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及免疫功能異常等，目前機(jī)制尚不明確。因而加強(qiáng)其發(fā)病機(jī)制的研究顯得非常重要。氧化應(yīng)激是指因生成亢進(jìn)或抗氧化機(jī)制受損而在機(jī)體內(nèi)發(fā)生的自由基和活性氧同蛋白、脂質(zhì)及核酸等體內(nèi)高分子反應(yīng)，致使后者的結(jié)構(gòu)、功能出現(xiàn)損害的狀態(tài)，造成機(jī)體內(nèi)活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）生成與清除平衡的嚴(yán)重破壞，活性氧蓄積，造成組織、細(xì)胞損傷的一種狀態(tài)。近年來大量的臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，諸多致肝損傷因素在其致病過程中不同程度伴隨氧化水平的升高或抗氧化能力的下降，氧化應(yīng)激貫穿各種肝病的全過程，是引起肝臟疾病的主要機(jī)制之一[10-11]。肝臟是機(jī)體氧化供能的主要場(chǎng)所，肝細(xì)胞線粒體含量豐富，極易產(chǎn)生大量ROS，直接或間接作用于肝細(xì)胞，使其受到氧化應(yīng)激的損傷。MAO和MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈的終產(chǎn)物，該指標(biāo)在肝細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時(shí)出現(xiàn)異常。持續(xù)的、不可逆的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞功能異常，最終導(dǎo)致死亡。MAO和MDA通常聯(lián)合應(yīng)用評(píng)價(jià)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，可以反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量組和高劑量組肝臟組織MAO及MDA隨服藥時(shí)間延長(zhǎng)有逐步升高的趨勢(shì)，尤其是高劑量組更明顯，第12周時(shí)達(dá)高峰，表明大黃素導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制可能與機(jī)體的氧化應(yīng)激有關(guān)。

本研究有十分重要的臨床指導(dǎo)意義。臨床醫(yī)師在使用中藥時(shí)，需要做到合理用藥，需要針對(duì)主要病因，進(jìn)行詳細(xì)辨證論治、君臣佐使、合理配方。同時(shí)用藥前詳細(xì)詢問病史和用藥史，重視特殊人群的用藥安全；熟悉藥性，減少不合理用藥；盡量避免使用或大劑量使用易致DILI的藥物；需要密切注意患者中藥使用過程中的臨床表現(xiàn)變化，尤其是乏力、食欲缺乏、尿黃、皮膚黃染的癥狀，部分患者可伴惡心、厭油、腹脹等消化道癥狀。體檢肝功能發(fā)現(xiàn)異常的患者，需要高度重視發(fā)生藥物性肝損傷的可能性并及時(shí)處理。加強(qiáng)中藥不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)中藥生藥及其制劑的質(zhì)量控制等[13]，使中醫(yī)藥更好地為人類的健康保駕護(hù)航。

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（童穎丹 編輯）

Mechanism of liver injury induced by high-dose Emodin in rats*

Bin ZHANG,Shen-hua DING,Xue-mei QIAN,Wei-shan ZHU
(Department of Liver Disease,Qingpu Branch of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 201700,P.R.China)

drug-induced liver injury;Emodin;pathology;oxidative stress

R285.5；R575.3

A

1005-8982（2015）35-0018-04

2015-04-14

上海市青浦區(qū)科委基金（No：青科發(fā)201210）

Abstrace:【Objective】To study the oxidative stress mechanism and liver pathology of Emodin-induced liver injury in rats.【Methods】According to Emodin daily intake,male Wistar rats were randomly divided into six groups including high-dose group,larger-dose group,medium-dose group,low-dose group,solvent group and normal group.In each group 5 rats were sacrificed in the 4th and 8th week.The remaining rats were all sacrificed in the 12th week.The liver and spleen index changes were studied.With the help of HE staining and the detection kit,the pathology and the expressions of malonaldehyde(MDA)and monoamine oxidase(MAO)in the liver tissue were both studied.【Results】Rat growth had no significant difference among the groups.There was no death or ascites formation in any group.The liver and spleen indexes of the high-dose group and larger-dose group had significantly rising trends.The inflammation activity in the liver tissue was significant in the larger-dose group and high-dose group after the 8th week,which was especially obvious in the high-dose group.The MAO and MDA content of the liver tissue had a rising trend in the larger-dose group and high-dose group,which reached the top at 12th week and more obvious in the high-dose group.【Conclusions】The rat liver injury model could be induced by high dose of Emodin.The oxidative stress mechanism may be associated with live injury,which needs to be explored further.