RP－HPLC法測(cè)定痛寧膠囊中葛根素含量

張玲昂，王俊杰，張松亮，劉 弘

痛寧膠囊由延胡索、徐長(zhǎng)卿、白芷、川芎、葛根、防風(fēng)、郁金、香附八味中藥組成［批準(zhǔn)文號(hào)：濟(jì)制字（2011）B11007］，具有理氣活血，祛風(fēng)止痛之功效。臨床用于氣滯血瘀所致的頭痛、腰痛、胃痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，療效確切。痛寧膠囊提取工藝設(shè)計(jì)了兩個(gè)步驟，延胡索醇提，其余七味藥材水提。其中醇提部分四氫帕馬丁含量已做研究，而水提部分未做研究，為了更好地反映制劑的整體質(zhì)量，采用RP－HPLC法對(duì)葛根中葛根素含量進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT高效液相色譜儀；SPD－M20A二極管陣列檢測(cè)器；島津LC－色譜工作站。葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)110752－200804）；痛寧膠囊批號(hào)為131127、131204、131210；甲醇為色譜醇；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇－水（24∶76），檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm；流速為 1.0 ml／min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量 10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品11.82 mg至100 ml容量瓶中，加甲醇適量溶解，定容，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細(xì)，精密稱取0.8 g，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇溶液 50 ml，稱重，超聲提取 0.5 h（功率為 200 W、頻率為 40 kHz），取出放冷，稱重，補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液4 ml至20 ml容量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按痛寧膠囊的處方及制備工藝制備不含葛根的樣品，按上述方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取上述制備的對(duì)照品，供試品，陰性對(duì)照溶液各10 μl，按色譜條件測(cè)定，葛根素峰和其他組分峰達(dá)到良好分離，陰性無(wú)干擾，出峰時(shí)間較快，見(jiàn)圖1。

圖1 葛根素的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素儲(chǔ)備液 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 ml至 20 ml容量瓶中， 加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。分別吸取10 μl進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定葛根素的峰面積。并以峰面積（A）對(duì)進(jìn)樣量（m）進(jìn)行線性回歸。回歸方程A＝3781445m＋12038，r＝0.9998； 結(jié) 果 表 明 葛 根 素 進(jìn) 樣 量 在0.0591～0.9456 μg 范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值的RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取室溫放置的供試品溶液，分別于0、3、6、12、24 h 注入色譜儀，測(cè)定葛根素峰面積，RSD 為0.83%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)的痛寧膠囊6份，制備成供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)得葛根素含量，RSD為0.83%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取葛根素對(duì)照品 19.02 mg至25 ml容量瓶中，加30%的乙醇溶液適量溶解，定容，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取已知含量的樣品9份（14.72 mg／g），0.1 g／份，置具塞錐形瓶中，分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液 1.6、2.0、2.4 ml，加入錐形瓶中，照供試品溶液的制備方法制備溶液，測(cè)定葛根素含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取3個(gè)批次樣品，依次為131127、131204、131210，制備成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，葛根素含量依次為 14.72、14.40、14.86 mg／g，表明制劑含量穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 目標(biāo)成分選擇 結(jié)合藥物提取工藝，延胡索醇提，其余藥材水提，最初的研究為選擇延胡索中四氫帕馬丁作為單指標(biāo)成分來(lái)定含量，但從提取過(guò)程看，其不能很好地反映制劑的水提工藝質(zhì)量，葛根具有痛經(jīng)活絡(luò)功效，用于項(xiàng)背強(qiáng)痛、眩暈頭痛、胸痹心痛等［1］，所以選擇其指標(biāo)成分做進(jìn)一步的研究。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)考察 經(jīng)過(guò)紫外掃描，葛根素在250 nm處有峰值，和多處參考資料相符，因此選擇此波長(zhǎng)段為檢測(cè)波長(zhǎng)［2－7］。

3.3 提取方法考察 依據(jù)葛根素理化性質(zhì)及所選提取溶劑為水并參考其他資料［2，3］，采用超聲提取，選擇甲醇在 20、30、40、50 min時(shí)取樣考察，發(fā)現(xiàn)在30 min后，提取量已無(wú)變化，且色譜圖雜峰較少，背景干凈，故選擇了甲醇超聲0.5 h。

3.4 流動(dòng)相考察 參照葛根素的常用流動(dòng)相檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)乙腈－水－磷酸［2］、甲醇－乙腈－水［3］、乙腈－水［4］、甲醇－水［5－7］系統(tǒng)進(jìn)行考察，通過(guò)對(duì)保留時(shí)間，分離度，拖尾因子等綜合分析，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)繁，最終選擇甲醇－水（24∶76）為流動(dòng)相。

本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確率高，重復(fù)性好，可作為痛寧膠囊中葛根素的含量測(cè)定方法；同時(shí)筆者也是想表述一個(gè)觀點(diǎn)，即對(duì)同一制劑，應(yīng)該在每一步工藝過(guò)程中確立一種指標(biāo)成分為這步含量測(cè)定的基準(zhǔn)，以此制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這樣可以使產(chǎn)品整體質(zhì)量更加清晰，便于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控和市場(chǎng)監(jiān)督，其可行性需更多的研究、論證和認(rèn)可。

［1］中華人民共和國(guó)藥典編委會(huì).中國(guó)藥典［S］.2010年版.第一部，312－313.

［2］張?jiān)?，?進(jìn)，陳 濤，等.暑熱寧合劑提取工藝優(yōu)化［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（24）：49－51.

［3］中華人民共和國(guó)藥典編委會(huì).中國(guó)藥典［S］.2010年版.第一部，1147.

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