微生物培養(yǎng)基中U（Ⅵ）和U（Ⅳ）測(cè)定方法的建立及穩(wěn)定性研究

劉小玲+陳曉明+阮晨+許燕+王+超+廖祥兵+宋收+羅學(xué)剛

摘 要 為了消除微生物培養(yǎng)基對(duì)U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質(zhì)量濃度測(cè)定的影響，建立微生物培養(yǎng)基中測(cè)定U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質(zhì)量濃度ρ的方法，優(yōu)化了在稀鹽酸體系中利用U（Ⅵ）制備U（Ⅳ）的條件：10 mg/L U（Ⅵ），鋅粒用量12 g/L，反應(yīng)時(shí)間180 min.通過測(cè)定ρ總U減去ρU（Ⅵ），計(jì)算出ρU（Ⅳ），建立了同時(shí)測(cè)量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）的分光光度法.微生物培養(yǎng)基對(duì)U（Ⅵ）和U（Ⅳ）有明顯影響：LB和NA培養(yǎng)基對(duì)U（Ⅵ）的影響率分別為37.3%和47.9%；單組分中蛋白胨和牛肉膏對(duì)U（Ⅵ）的影響率較大，分別達(dá)到33.5%和19.7%；而U（Ⅵ）和U（Ⅳ）在TGY培養(yǎng)基中較穩(wěn)定.采用該方法測(cè)量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ），能消除微生物培養(yǎng)基對(duì)U的影響，且具有精密度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)生物樣品中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）的快速測(cè)量.

關(guān)鍵詞 U（Ⅳ）的制備；分光光度法；微生物培養(yǎng)基；U穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) O614.62 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2015）03-0022-07

隨著核工業(yè)的發(fā)展，含U放射性廢物不斷進(jìn)入環(huán)境中，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅.地殼表層平均鈾含量為3 μg/g[1].鈾礦冶、核電站、核武器實(shí)驗(yàn)等含鈾廢水中，鈾的質(zhì)量濃度約為5 mg/L，遠(yuǎn)高于國家排放標(biāo)準(zhǔn)（0.05 mg/L），也遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水標(biāo)準(zhǔn)最高鈾質(zhì)量濃度50 μg/L [2-3].高濃度鈾的放射性和化學(xué)毒性影響動(dòng)物和人體腎臟和骨骼的正常功能[4]，因此，U污染的環(huán)境修復(fù)問題已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn).據(jù)報(bào)道微生物修復(fù)U污染比物理化學(xué)修復(fù)更具有顯著優(yōu)勢(shì)[5].自然環(huán)境中，U有Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ 4種價(jià)態(tài)，U（Ⅲ）和U（V）不穩(wěn)定，極易歧化，因此U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）是兩種最主要的價(jià)態(tài)[6].

因U易受環(huán)境中pH值、有機(jī)物、氧化還原條件等的影響，其化學(xué)形態(tài)在實(shí)際環(huán)境體系中可互相轉(zhuǎn)化，增加了U價(jià)態(tài)分析的難度.

目前，微生物培養(yǎng)基中U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）的測(cè)量方法為偶氮胂（Ⅲ）分光光度法[7-8].其原理是U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）在酸性條件下與偶氮胂（Ⅲ）形成1∶1絡(luò)合物，在特定波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度[9-10].但偶氮胂（Ⅲ）分光光度法在U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質(zhì)量濃度的測(cè)量過程中，忽略了微生物培養(yǎng)基對(duì)U的影響及U（Ⅳ）的不穩(wěn)定性，而不能同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)量其中U（Ⅳ）的質(zhì)量濃度.因此，為了深入研究微生物對(duì)U的氧化還原作用，有必要在微生物培養(yǎng)基中建立一種能同時(shí)測(cè)量U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質(zhì)量濃度的方法.

通過將U的多形態(tài)分析轉(zhuǎn)為單一形態(tài)分析，即運(yùn)用分光光度法，通過U的氧化還原，測(cè)量體系中U（Ⅵ）和總U的質(zhì)量濃度ρ，ρ總U減去ρU（Ⅵ）得出ρU（Ⅳ），可消除培養(yǎng)基中U（Ⅳ）不穩(wěn)定性及微生物培養(yǎng)基對(duì)其影響問題.U（Ⅳ）作為U（Ⅵ）的還原產(chǎn)物，也是氧化還原過程中的反應(yīng)試劑，其制備方法包括還原劑還原法（金屬還原劑、汞齊及合金還原劑、低價(jià)金屬化合物）、電化學(xué)法、光催化法等[11].其中部分還原方法操作復(fù)雜、易受還原劑、催化劑及反應(yīng)條件等的限制.因此需尋找一種操作過程簡(jiǎn)單、不易引入干擾物質(zhì)，避免在HCl、HF、稀H2SO4、低濃度HClO4中U（Ⅵ）還原產(chǎn)物U（Ⅳ）的再氧化作用的U（Ⅳ）制備方法；再運(yùn)用U的氧化還原過程建立U（Ⅵ）和U（Ⅳ）的分光光度法；通過該方法研究U（Ⅵ）和U（Ⅳ）在微生物培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，為微生物固定U（Ⅵ）選用適合的培養(yǎng)基提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

TGY培養(yǎng)基（胰蛋白胨酵母葡萄糖培養(yǎng)基）：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，葡萄糖1 g，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2.

LB培養(yǎng)基（溶菌肉湯培養(yǎng)基）：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4.

NA培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，定容至1 000 mL，pH 7.0.

1 000 mg/L U（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1.782 2 g醋酸雙氧U（UO2（CH3COO）2·H2O上海譜振生物科技有限公司），溶解并定容至1 000 mL，搖勻，避光保存，其他各濃度U（Ⅵ）由此溶液稀釋獲得.

0.05%偶氮胂（Ⅲ）顯色液（上海阿拉?。号嫉希á螅?.05 g，定容至100 mL.

無砷鋅粒（成都市科龍化工試劑廠）.其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 U（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取1 000 mg/L U（Ⅵ） 2 mL，去離子水定容至50 mL，配制成40 mg/L U（Ⅵ），8支10 mL比色管，分別加入40 mg/L U（Ⅵ）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2 mL，0.05%偶氮胂Ⅲ1 mL，緩沖液定容至10 mL，充分搖勻，靜置30 min，于652 nm處測(cè)其吸光度.

1.3 U（Ⅳ）的制備方法優(yōu)化

在6 mol/L HCl介質(zhì)中，以鋅粒為還原劑，考察U（Ⅵ）初始濃度、鋅粒用量、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)U（Ⅳ）制備的影響，得出優(yōu)化條件[12].最后測(cè)量溶液殘留U（Ⅵ），考察U（Ⅳ）的生成率.

U（Ⅵ）的生成率（%）=ρ1-ρ2ρ1×100%，（1）

式中ρ1為U（Ⅵ）起點(diǎn)質(zhì)量濃度，mg/L；ρ2為U（Ⅵ）殘留質(zhì)量濃度，mg/L.

1.3.1 初始U（Ⅵ）質(zhì)量濃度對(duì)U（Ⅳ）制備的影響 分別取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒0.6 g，使其用量為12 g/L，定容.U（Ⅵ）最終分別為4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/L.

1.3.2 鋅粒用量對(duì)U（Ⅳ）制備的影響 取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 g，定容.使鋅粒用量分別為4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L.

1.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)U（Ⅳ）制備的影響 取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒使其用量為12 g/L，反應(yīng)時(shí)間分別為90，120，150，180，210 min，定容.

1.4 微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）測(cè)試方法的建立

1.4.1 微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）分光光度法的建立 微生物培養(yǎng)基中U（Ⅳ）由于易受溫度、空氣中氣體、體系中酸性介質(zhì)等影響發(fā)生氧化，造成形態(tài)發(fā)生變化.在U（Ⅵ）和U（Ⅳ）的微生物培養(yǎng)基混合體系中，運(yùn)用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法先測(cè)量樣品中ρU（Ⅵ），另取樣品將U（Ⅳ）氧化成總U，利用ρ總U減去ρU（Ⅵ）得出ρU（Ⅳ），即整個(gè)研究過程中通過ρU（Ⅵ）和ρ總U定量ρU（Ⅳ），使多組分分析轉(zhuǎn)換成單組分分析.該方法解決了微生物培養(yǎng)基對(duì)U的影響及U（Ⅳ）的不穩(wěn)定性問題，能同時(shí)測(cè)量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）.

偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測(cè)試ρU（Ⅵ）：取2 mL樣品，1 mL 0.05%偶氮胂（Ⅲ）顯色液，0.4 mol/L氯乙酸-0.4 mol/L氯乙酸鈉緩沖液定容至10 mL，靜置30 min，波長(zhǎng)652 nm處測(cè)量其吸光度；偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測(cè)試ρU（Ⅳ）則先測(cè)試樣品中ρU（Ⅵ），另取2 mL樣品采用1 mL濃硝酸加熱趕酸，保持微沸狀態(tài)，直到出現(xiàn)白色殘?jiān)鼮橹梗芙獠⒍ㄈ葜? mL.用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測(cè)試ρU（Ⅵ），此為ρ總U.含U混合體系中ρU（Ⅳ）由兩者的差值得出.ρU（Ⅳ）按式（2）計(jì)算：

ρU（Ⅳ）=ρ總U-ρU（Ⅵ）.（2）

式中 ρU（Ⅳ）為U（Ⅳ）質(zhì)量濃度，mg/L；ρ總U為總U質(zhì)量濃度，mg/L；ρU（Ⅵ） 為U（Ⅵ）質(zhì)量濃度，mg/L.

1.4.2 濃硝酸用量對(duì)U（Ⅳ）氧化率的影響 取10 mg/L U（Ⅳ）25 mL于容量瓶中，TGY培養(yǎng)基定容至50 mL.分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL濃硝酸對(duì)2 mL培養(yǎng)基中的U（Ⅳ）進(jìn)行氧化，反應(yīng)完成后偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測(cè)量ρU（Ⅵ），即ρ總U.考察濃硝酸用量對(duì)U（Ⅳ）氧化率的影響，U（Ⅳ）的氧化率按式（3）計(jì)算：

氧化率（%）U（Ⅳ）=ρU（Ⅵ）ρ總U×100%.（3）

式中ρU（Ⅵ）為U（Ⅵ）質(zhì)量濃度，mg/L；ρ總U為總U質(zhì)量濃度，mg/L.

1.5 U在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究

1.5.1 U（Ⅵ）在TGY，LB，NA培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究 取過濾除菌1 000 mg/L U（Ⅵ） 1 mL，分別加入至已滅菌的99 mL NA，LB，TGY的液體培養(yǎng)基中，得到最終10 mg/L U（Ⅵ）.30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h 取樣，測(cè)量微生物培養(yǎng)基對(duì)U（Ⅵ）的影響率.微生物培養(yǎng)基對(duì)U（Ⅵ）的影響率按式（4）計(jì)算：

影響率（%）=ρ1-ρ2ρ1×100%.（4）

式中ρ1為U（Ⅵ）起點(diǎn)質(zhì)量濃度，mg/L；ρ2為U（Ⅵ）殘留質(zhì)量濃度，mg/L.

1.5.2 培養(yǎng)基單組分對(duì)U（Ⅵ）穩(wěn)定性的影響 按單組分在微生物培養(yǎng)基中的比例，即3 g/L酵母粉，10 g/L 蛋白胨，3 g/L牛肉膏，5 g/L胰蛋白胨，1 g/L葡萄糖，10 g/L氯化鈉的液體培養(yǎng)基中加入過濾除菌的1 000 mg/L U（Ⅵ） 1 mL，得到最終10 mg/L U（Ⅵ）.30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h取樣，考察培養(yǎng)基單組分對(duì)U（Ⅵ）的影響.

1.5.3 U（Ⅳ）在TGY培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究 等體積混合過濾除菌的10 mg/L U（Ⅳ）與滅菌TGY培養(yǎng)基， 30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h取樣.含U混合體系中，測(cè)量2 mL樣品中ρU（Ⅵ），另取2 mL樣品加入1 mL濃硝酸將其中U（Ⅳ）硝化為總U，測(cè)ρ總U，ρU（Ⅵ），計(jì)算出ρU（Ⅳ），考察TGY培養(yǎng)基中U（Ⅳ）的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 U（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以U（Ⅵ）質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，擬合后得到U（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示.可知標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.040x-0.007，R2=0.999，在ρU=0.0～20.0 mg/L范圍內(nèi)，吸光度-ρU關(guān)系符合比爾定律.

2.2 U（Ⅳ）的制備方法優(yōu)化

2.2.1 ρU（Ⅵ）對(duì)U（Ⅳ）制備的影響 保持反應(yīng)體系中的ρU（Ⅵ）分別為4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/L，HCl濃度6 mol/L，鋅粒12 g/L，總反應(yīng)體積為50 mL.U（Ⅳ）生成率隨U（Ⅵ）初始濃度的變化見圖2.由圖2可知，在4～10 mg/L U（Ⅵ）終濃度范圍內(nèi)，U（Ⅳ）生成率隨著ρU（Ⅵ）的增大保持穩(wěn)定狀態(tài)，達(dá)到95%左右.但ρU（Ⅵ）為10～20 mg/L時(shí)，U（Ⅳ）生成率隨著ρU（Ⅵ）的增加，生成率急劇下降.因此，選擇最適ρU（Ⅵ）為10 mg/L.

2.2.2 鋅粒用量對(duì)U（Ⅳ）制備的影響 保持反應(yīng)體系中的ρU（Ⅵ）為10 mg/L，HCl濃度為6 mol/L，總反應(yīng)體積為50 mL，反應(yīng)體系中的鋅粒用量分別為4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L.U（Ⅳ）生成率隨鋅粒用量的變化見圖3.由圖3可知，鋅粒用量在4～12 g/L范圍內(nèi)，U（Ⅳ）生成率隨著鋅粒濃度的增加而增大.當(dāng)鋅粒用量為12 g/L時(shí)，生成率達(dá)到最大.但當(dāng)鋅粒用量大于28 g/L時(shí)，生成率呈明顯減小趨勢(shì)，且有典型的黑色絮狀沉淀.推測(cè)鋅粒過量時(shí)，會(huì)對(duì)ρU（Ⅵ）的測(cè)量有較大影響.因此選擇最適宜鋅粒用量為12 g/L.