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      新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

      2015-07-13 05:21:42祖路皮亞·載買爾阿曼古力·海瓦爾吾甫爾米吉提
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年15期

      祖路皮亞·載買爾 阿曼古力·海瓦爾 吾甫爾?米吉提

      摘要 [目的]篩選出對(duì)重金屬抗性較好的微藻品系,給相關(guān)研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。[方法]利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡確定XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株荒漠微藻品系的細(xì)胞形態(tài)。在實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定生長(zhǎng)曲線,同時(shí),測(cè)定不同濃度重金屬(Hg2+、Cd2+、Pb2+)和抗生素(氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素)對(duì)3株微藻品系生長(zhǎng)的影響,并確定最佳抗性濃度。[結(jié)果]3株品系的細(xì)胞均為球形,XLDB3的細(xì)胞個(gè)體大,XLDB9和XLDB12的細(xì)胞壁很厚。3株品系的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng);它們對(duì)重金屬和抗生素均有一定的抗性,其中XLDB12對(duì)Hg2+和XLDB3對(duì)Pb2+的抗性最強(qiáng),分別達(dá)到0.05和0.8 mmol/L,3株品系對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L,對(duì)氨芐青霉素有很好的抗性,均達(dá)到1 000 μg/ml,XLDB3對(duì)四環(huán)素和鏈霉素的抗性最強(qiáng),分別為60與40 μg/ml。[結(jié)論]該研究可為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

      關(guān)鍵詞 荒漠微藻;重金屬抗性;抗生素抗性

      中圖分類號(hào) S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2015)15-205-04

      Preliminary Analysis of Heavy Metal Resistance of the Three Desert Microalgae in Yuli County of Xinjiang

      ZULPIYE Zemir, AMANGVL Hewer, GHOPUR Mijit*

      (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046)

      Abstract [Objective] To select the microalgae strains which have better resistance to heavy metals, provide test data for correlational studies. [Method] OM and TEM were used to observe the cell morphology of XLDB3,XLDB9,XLDB12. The growth curve of three different microalgae under the laboratory conditions were measured. Different concentrations of heavy metals (Hg2+, Cd2+, Pb2+) added based on the growth condition. Antibiotics (Ampicillin, Tetracycline and Streptomycin) were employed to measure its tolerant ability in that adversity, and also the best resistance concentrations were determined. [Result] Three microalgae (XLDB3, XLDB9, XLDB12) cells were spherical, and XLDB3 cell was big , XLDB9 and XLDB12 cell walls were very thick. Three strains of microalgae growth cycle were long. They have a certain amount of resistance to heavy metals and antibiotics; XLDB12 and XLDB3 have strongest resistance to have metal mercury and lead were found in this test respectively (0.05 mmol/L for Hg2+ ,0.8 mmol/L for Pb2+ ). Three strains of microalgae have a same resistance to have metal cadmium was found (0.05 mmol/L for Cd2+). Expressed remarkable adaptation potential to antibiotic, with the resistant rate of ampicillin up to 1 000 μg/ml, and XLDB3 have strongest resistance to Tetracycline and Streptomycin up to 60 and 40 μg/ml respectively . [Conclusion] The study can provide reference basis for interaction of microalgae and heavy metal, as well as purification technology of desert microalgae.

      Key words Desert microalgae; Heavy metal resistance; Antibiotic resistance

      藻類是環(huán)境中進(jìn)化并完全適應(yīng)于生存環(huán)境的,含有葉綠素和完成含氧的光合作用的大量并多種多樣的有機(jī)體?;哪孱愂峭寥涝澹⊿oil Algae)的一個(gè)群體,主要是指生長(zhǎng)在荒漠化地區(qū)上的微藻體[1]。藻類細(xì)胞壁分內(nèi)外兩層,外層為由纖維素、果膠質(zhì)、藻酸銨巖藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結(jié)構(gòu),內(nèi)層主要成分是纖維素。細(xì)胞壁上帶有一定電荷和粘性,增加了對(duì)重金屬離子的吸附能力。

      目前,水污染已成為非常重要的環(huán)境問(wèn)題。隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和工業(yè)生產(chǎn)的加快,重金屬在化工、有色冶煉、電鍍、印染和農(nóng)業(yè)等方面廣泛應(yīng)用[2],重金屬的污染也逐漸嚴(yán)重。從 2009 年至今,我國(guó)已經(jīng)有 30 多起重特大重金屬污染事件,重金屬污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了我國(guó)人民的生活,重金屬污染必須引起我們的重視[3] 。過(guò)量的重金屬離子對(duì)生物體具有毒性作用,它們通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體和人體內(nèi)而引起各種疾病。這些污染物不僅直接傷害人類健康,破壞環(huán)境,而且還會(huì)給經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失。

      傳統(tǒng)的重金屬水處理方法有化學(xué)沉淀法、離子交換法、電解化學(xué)法、蒸發(fā)濃縮法、膜技術(shù)和活性炭吸附工藝法等[4-5]。這些方法和技術(shù)具有效率高,時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),但是不適合大規(guī)模利用 [6]。因此,利用簡(jiǎn)單而自然的原料和生物資源的生物吸附作用(例如細(xì)菌、真菌、酵母、藻類等)來(lái)處理是最佳選擇。與其他生物吸附劑相比,藻類具有較強(qiáng)的吸附性能,并且來(lái)源豐富。利用藻類治理重金屬污水已為眾多的研究證明具有高效,低耗,環(huán)保的特點(diǎn)[7]。在此基礎(chǔ)上探索藻類對(duì)重金屬?gòu)U水的生物吸附技術(shù)已逐漸成為國(guó)際水體污染處理研究中的一個(gè)新熱點(diǎn)。

      在土壤微藻的分離純化過(guò)程中存在著大量的不同種類的細(xì)菌,這些細(xì)菌與藻類之間存在著密切的關(guān)系,它們既可能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng),也可能抑制其生長(zhǎng),因此藻與菌之間的關(guān)系一直是微藻研究重要課題之一。為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)而經(jīng)常使用抗生素,所以研究土壤微藻對(duì)抗生素的抗性有其特定的生物學(xué)及實(shí)用意義。

      該試驗(yàn)研究了重金屬(Hg2+、Pb2+、Cd2+)和抗生素(氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素)對(duì)3株微藻品系生長(zhǎng)的影響,并對(duì)3株微藻對(duì)重金屬和抗生素的抗性進(jìn)行比較,以期為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 藻種及培養(yǎng)

      試驗(yàn)所用的綠囊藻(XLDB3)、Marvania(XLDB12)和小球藻(XLDB9)是新疆大學(xué)植物生物技術(shù)校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物細(xì)胞研究室從新疆富蘊(yùn)縣荒漠樣本中分離純化而得到的。藻株的培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為光強(qiáng)度為800~2 000 Lux,溫度為18~26 ℃,明暗周期為18 h∶8 h。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,各操作步驟均進(jìn)行滅菌處理(120 ℃,30 min)。

      1.2 試驗(yàn)試劑

      HgCl2、CdCl2·2.5H2O、PbCl2為國(guó)產(chǎn)藥品,用雙重水定容至0.05 mol/L母液,存于容量瓶中備用。氨芐青霉素鈉鹽和四環(huán)素鹽酸鹽分別用雙重水定容至100和10 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液,鏈霉素硫酸鹽用無(wú)水乙醇定容至50 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,貯存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 3種藻類生長(zhǎng)的測(cè)定。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞并接種新配制的BBM液體培養(yǎng)基,接種量為4.7×104個(gè)/ml,每天人工搖1~2次。每天定時(shí)取樣測(cè)定650 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

      1.3.2 3種藻類的細(xì)胞形態(tài)觀察。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液取1 ml加入NaN3抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),制備切片用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。制備切片[8]利用透射電鏡觀察細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。

      1.3.3 3種藻類的抗重金屬特性檢測(cè)。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種重金屬離子的母液(用針頭過(guò)濾器過(guò)濾),配制成的汞離子濃度分別為0.000 5、0.001 0、0.003 0、0.005 0、0.010 0 mmol/L,鉛離子的濃度分別為 0.3、0.4、05、0.6、0.8、1.0 mmol//L,鎘離子的濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。以不加重金屬的空白組作為對(duì)照,3種藻株以4.7×104個(gè)/ml的接種量接入上述含不同濃度重金屬的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)梯度3 個(gè)平行組,每天人工搖1~2次。每天定時(shí)取樣測(cè)定650 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

      1.3.4 3種品系的抗生素抗性檢測(cè)。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種抗生素,配成的氨芐青霉素濃度分別為40、45、50、55、60、100、250、500、1 000 μg/ml,四環(huán)素濃度分別為

      2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml,鏈霉素濃度分別為1、2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml,以萊茵衣野生型

      品系CC124作對(duì)照。4種藻株按4.7×104個(gè)/ml接種量接入含不同濃度抗生素的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)梯度3 個(gè)平行組。每天人工搖1~2次,觀察細(xì)胞是否生長(zhǎng)。

      1.3.5 數(shù)據(jù)分析。

      試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行分析。用Excel作圖。

      2 結(jié)果

      2.1 3種藻株的生長(zhǎng)曲線

      圖1表示了XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株品系的生長(zhǎng)情況。從圖1可知,3株品系在第4天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在第10天由對(duì)數(shù)期末期轉(zhuǎn)入了衰亡期,整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)穩(wěn)定期,該3株品系的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。

      圖1 3種品系的生長(zhǎng)曲線

      2.2 3株品系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

      由圖2可知,品系XLDB3的細(xì)胞是球形,細(xì)胞體大;亞顯微結(jié)構(gòu)很特殊,細(xì)胞的核區(qū)很明顯,核區(qū)周圍可以看出淀粉粒,細(xì)胞壁不厚,沒(méi)有發(fā)達(dá)的液泡。品系XLDB9的細(xì)胞是球形,與品系XLDB3相比,細(xì)胞體很小,細(xì)胞內(nèi)有較大的液泡。該品系的細(xì)胞壁很厚,葉綠體很明顯,液泡系特別發(fā)達(dá)。品系XLDB12的細(xì)胞也是球形,與品系XLDB3相比,細(xì)胞體很小,細(xì)胞壁很厚,核區(qū)很明顯。

      2.3 3株品系的重金屬抗性檢測(cè)

      2.3.1 Hg2+對(duì)3株品系生長(zhǎng)的影響。

      由圖3可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),3株微藻的吸光值不斷增加,但試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)隨著( Hg2+)的增加,吸光值不斷降低,6 d后更明顯(P<005)。藻株XLDB3和XLDB9在5種濃度組[ρ(Hg2+)≤0010 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異顯著(P<005),高濃度組 [0.003 mmol/L≤ρ(Hg2+)≤0010 mmol/L] 的藻細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停止,說(shuō)明5種濃度的Hg2+抑制該2株品系的生長(zhǎng),ρ(Hg2+)≥0.005 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB3的死亡,ρ(Hg2+)≥0.003 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB9的死亡。藻株XLDB12低濃度組[ρ(Hg2+)≤0005 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著(P>005);高濃度組[ρ(Hg2+)=0.010 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎停止了生長(zhǎng),說(shuō)明ρ(Hg2+)≤0050 mmol/L的Hg2+對(duì)該品系生長(zhǎng)的抑制不明顯,XLDB12對(duì)0.050 mmol/L的Hg2+有抗性。XLDB12對(duì)金屬Hg2+的抗性高于XLDB3和XLDB9,XLDB12對(duì)Hg2+的抗性達(dá)到0.050 mmol/L。

      43卷15期 祖路皮亞·載買爾等 新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

      2.3.2 Pb2+對(duì)3種藻株生長(zhǎng)的影響。

      由圖4可知,Pb2+對(duì)3種微藻生長(zhǎng)的影響與Hg2+不相同。XLDB3在5種濃度組[ρ(Pb2+)≤1.0 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05),都高于對(duì)照組,4 d后高濃度組[ρ(Pb2+)=1.0 mmol/L]的吸光值不斷降低,藻細(xì)胞幾乎死亡,說(shuō)明ρ(Pb2+)≤0.8 mmol/L的Pb2+促進(jìn)XLDB3的生長(zhǎng),1.0 mmol/L 的Pb2+導(dǎo)致該品系的死亡,因此,XLDB3對(duì)Pb2+抗性達(dá)到0.8 mmol/L。前4 d內(nèi)XLDB9和XLDB12在5種濃度組[ρ(Pb2+)≤1.0 mmol/L] 的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05),都高于對(duì)照組,4 d后XLDB9高濃度組[ρ(Pb2+)>0.4 mmol/L]的吸光值和XLDB12在5種濃度組[ρ(Pb2+)≤1.0 mmol/L] 的吸光值不斷降低(P<0.05),第6天藻細(xì)胞幾乎死亡,說(shuō)明前4 d內(nèi)5種濃度的Pb2+促進(jìn)XLDB9和XLDB12的生長(zhǎng),4 d后0.3和0.4 mmol/L濃度下XLDB9的藻細(xì)胞仍然生長(zhǎng),其他濃度組的生長(zhǎng)受到抑制,而XLDB12在5種濃度的生長(zhǎng)都受強(qiáng)烈的抑制,最后都死亡。因此,XLDB9對(duì)Pb2+抗性達(dá)到0.4 mmol/L。XLDB3

      2.3.3 Cd2+對(duì)3種藻株生長(zhǎng)的影響。

      由圖5可知,前4 d內(nèi)XLDB3和XLDB12在5種濃度組的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05),4 d后該2株藻高濃度組[ρ(Cd2+)≥0.10 mmol/L]的吸光值不斷降低(P<0.05),第6天藻細(xì)胞幾乎死亡,說(shuō)明前4 d內(nèi)5種濃度的Cd2+對(duì)該2種品系生長(zhǎng)的影響不明顯,4 d后高濃度組[ρ(Cd2+)≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,到第6天細(xì)胞死亡,因此,XLDB3和XLDB12對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L。在10 d內(nèi),XLDB9低濃度組[ρ(Cd2+)≤0.05 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05),而高濃度組[ρ(Cd2+)≥010 mmol/L] 的吸光值與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),第4天高濃度組[ρ(Cd2+)≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎死亡,說(shuō)明高濃度組的Cd2+強(qiáng)烈抑制該品系的生長(zhǎng),XLDB9對(duì)Cd2+的抗性也達(dá)到0.05 mmol/L。3株品系對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L,其中XLDB3的抗性較強(qiáng)。

      2.4 3株品系的抗生素抗性檢測(cè)

      2.4.1 氨芐青霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

      從表1可知,氨芐青霉素濃度為40~1 000 μg/ml時(shí),4株品系都能正常生長(zhǎng),它們對(duì)氨芐青霉素的抗性均達(dá)到1 000 μg/ml,其中XLDB12的抗性最強(qiáng)。

      2.4.2 四環(huán)素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

      從表2可知,四環(huán)素濃度為2.5~60 μg/ml時(shí),XLDB3和對(duì)照CC124在最高濃度中正常生長(zhǎng),而XLDB9和XLDB12能生長(zhǎng)的最高濃度是40 μg/ml。因此,該4株品系中CC124對(duì)四環(huán)素的抗性較強(qiáng),已達(dá)到60 μg/ml。

      2.4.3 鏈霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

      從表3可知,鏈霉素濃度為1~60 μg/ml時(shí),對(duì)照CC124和XLDB3能生長(zhǎng)的最高鏈霉素濃度為40 μg/ml,而XLDB9和XLDB12只能生長(zhǎng)在1和2.5 μg/ml濃度中。該4株品系之中CC124對(duì)鏈霉素的抗性較強(qiáng),已達(dá)到40 μg/ml。

      3 結(jié)論與討論

      通過(guò)該試驗(yàn)可知,3株微藻對(duì)Hg2+和Pb2+的抗性存在較大的差別,它們對(duì)Hg2+的抗性大小順序?yàn)閄LDB12>XLDB3>XLDB9,對(duì)Pb2+的抗性大小順序?yàn)閄LDB3>XLDB9>XLDB12,對(duì)Cd2+的抗性基本一致。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),氨芐青霉素對(duì)3株微藻品系和對(duì)照CC124的生長(zhǎng)均沒(méi)有明顯的影響,當(dāng)氨芐青霉素濃度在40~1 000 μg/ml之間變化時(shí),4株品系均具有抗性,抗性大小順序?yàn)閄LDB12> XLDB9> CC124> XLDB3。四環(huán)素對(duì)XLDB3和對(duì)照CC124生長(zhǎng)的影響不明顯,該兩株品系對(duì)四環(huán)素均具有抗性,而四環(huán)素對(duì)XLDB9和XLDB12生長(zhǎng)的影響較明顯,當(dāng)濃度為2.5~40 μg/ml時(shí),該2株微藻均有較弱的抗性,濃度到45 μg/ml時(shí)細(xì)胞就死亡,它們的抗性大小順序?yàn)镃C124> XLDB3> XLDB12 > XLDB9。鏈霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響很明顯,當(dāng)濃度為1~40 μg/ml時(shí),XLDB3和CC124均有較強(qiáng)的抗性,濃度到45 μg/ml時(shí)細(xì)胞死亡,而鏈霉素濃度為5 μg/ml時(shí),XLDB9和XLDB12都死亡,它們的抗性大小順序?yàn)镃C124> XLDB3>XLDB9> XLDB12。

      由于藻類細(xì)胞表面具有與重金屬離子結(jié)合的帶負(fù)電荷的官能團(tuán),使其在藻細(xì)胞的表面和內(nèi)部沉積,因此,抑制藻類生長(zhǎng)的主要原因被認(rèn)為是重金屬離子與藻類的親和性,并且親和性越強(qiáng)毒性越大[9]。藻細(xì)胞可以有效降低重金屬離子對(duì)本身的脅迫作用,但隨著重金屬濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),微藻的正常生理功能受到嚴(yán)重傷害,從而逐漸喪失了對(duì)脅迫的調(diào)節(jié)能力[10]。

      抗生素對(duì)藻細(xì)胞的作用是多方面的,抗生素對(duì)藻體本身有直接的作用,既可能抑制藻類的生長(zhǎng),又可能在特定濃度時(shí)刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧在低濃度范圍內(nèi)的增多,從而促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)。不同抗生素的作用機(jī)理是各不相同的。

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