新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

祖路皮亞·載買爾　阿曼古力·海瓦爾　吾甫爾?米吉提

摘要 [目的]篩選出對(duì)重金屬抗性較好的微藻品系，給相關(guān)研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。[方法]利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡確定XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株荒漠微藻品系的細(xì)胞形態(tài)。在實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定生長(zhǎng)曲線，同時(shí)，測(cè)定不同濃度重金屬（Hg2+、Cd2+、Pb2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素）對(duì)3株微藻品系生長(zhǎng)的影響，并確定最佳抗性濃度。[結(jié)果]3株品系的細(xì)胞均為球形，XLDB3的細(xì)胞個(gè)體大，XLDB9和XLDB12的細(xì)胞壁很厚。3株品系的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)；它們對(duì)重金屬和抗生素均有一定的抗性，其中XLDB12對(duì)Hg2+和XLDB3對(duì)Pb2+的抗性最強(qiáng)，分別達(dá)到0.05和0.8 mmol/L，3株品系對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L，對(duì)氨芐青霉素有很好的抗性，均達(dá)到1 000 μg/ml，XLDB3對(duì)四環(huán)素和鏈霉素的抗性最強(qiáng)，分別為60與40 μg/ml。[結(jié)論]該研究可為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 荒漠微藻；重金屬抗性；抗生素抗性

中圖分類號(hào) S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-205-04

Preliminary Analysis of Heavy Metal Resistance of the Three Desert Microalgae in Yuli County of Xinjiang

ZULPIYE Zemir， AMANGVL Hewer， GHOPUR Mijit*

（College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi， Xinjiang 830046）

Abstract [Objective] To select the microalgae strains which have better resistance to heavy metals， provide test data for correlational studies. [Method] OM and TEM were used to observe the cell morphology of XLDB3，XLDB9，XLDB12. The growth curve of three different microalgae under the laboratory conditions were measured. Different concentrations of heavy metals （Hg2+， Cd2+， Pb2+） added based on the growth condition. Antibiotics （Ampicillin， Tetracycline and Streptomycin） were employed to measure its tolerant ability in that adversity， and also the best resistance concentrations were determined. [Result] Three microalgae （XLDB3， XLDB9， XLDB12） cells were spherical， and XLDB3 cell was big ， XLDB9 and XLDB12 cell walls were very thick. Three strains of microalgae growth cycle were long. They have a certain amount of resistance to heavy metals and antibiotics； XLDB12 and XLDB3 have strongest resistance to have metal mercury and lead were found in this test respectively （0.05 mmol/L for Hg2+ ，0.8 mmol/L for Pb2+ ）. Three strains of microalgae have a same resistance to have metal cadmium was found （0.05 mmol/L for Cd2+）. Expressed remarkable adaptation potential to antibiotic， with the resistant rate of ampicillin up to 1 000 μg/ml， and XLDB3 have strongest resistance to Tetracycline and Streptomycin up to 60 and 40 μg/ml respectively . [Conclusion] The study can provide reference basis for interaction of microalgae and heavy metal， as well as purification technology of desert microalgae.

Key words Desert microalgae； Heavy metal resistance； Antibiotic resistance

藻類是環(huán)境中進(jìn)化并完全適應(yīng)于生存環(huán)境的，含有葉綠素和完成含氧的光合作用的大量并多種多樣的有機(jī)體?；哪孱愂峭寥涝澹⊿oil Algae）的一個(gè)群體，主要是指生長(zhǎng)在荒漠化地區(qū)上的微藻體[1]。藻類細(xì)胞壁分內(nèi)外兩層，外層為由纖維素、果膠質(zhì)、藻酸銨巖藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)層主要成分是纖維素。細(xì)胞壁上帶有一定電荷和粘性，增加了對(duì)重金屬離子的吸附能力。

目前，水污染已成為非常重要的環(huán)境問(wèn)題。隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和工業(yè)生產(chǎn)的加快，重金屬在化工、有色冶煉、電鍍、印染和農(nóng)業(yè)等方面廣泛應(yīng)用[2]，重金屬的污染也逐漸嚴(yán)重。從 2009 年至今，我國(guó)已經(jīng)有 30 多起重特大重金屬污染事件，重金屬污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了我國(guó)人民的生活，重金屬污染必須引起我們的重視[3] 。過(guò)量的重金屬離子對(duì)生物體具有毒性作用，它們通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體和人體內(nèi)而引起各種疾病。這些污染物不僅直接傷害人類健康，破壞環(huán)境，而且還會(huì)給經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失。

傳統(tǒng)的重金屬水處理方法有化學(xué)沉淀法、離子交換法、電解化學(xué)法、蒸發(fā)濃縮法、膜技術(shù)和活性炭吸附工藝法等[4-5]。這些方法和技術(shù)具有效率高，時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但是不適合大規(guī)模利用 [6]。因此，利用簡(jiǎn)單而自然的原料和生物資源的生物吸附作用（例如細(xì)菌、真菌、酵母、藻類等）來(lái)處理是最佳選擇。與其他生物吸附劑相比，藻類具有較強(qiáng)的吸附性能，并且來(lái)源豐富。利用藻類治理重金屬污水已為眾多的研究證明具有高效，低耗，環(huán)保的特點(diǎn)[7]。在此基礎(chǔ)上探索藻類對(duì)重金屬?gòu)U水的生物吸附技術(shù)已逐漸成為國(guó)際水體污染處理研究中的一個(gè)新熱點(diǎn)。

在土壤微藻的分離純化過(guò)程中存在著大量的不同種類的細(xì)菌，這些細(xì)菌與藻類之間存在著密切的關(guān)系，它們既可能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，也可能抑制其生長(zhǎng)，因此藻與菌之間的關(guān)系一直是微藻研究重要課題之一。為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)而經(jīng)常使用抗生素，所以研究土壤微藻對(duì)抗生素的抗性有其特定的生物學(xué)及實(shí)用意義。

該試驗(yàn)研究了重金屬（Hg2+、Pb2+、Cd2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素）對(duì)3株微藻品系生長(zhǎng)的影響，并對(duì)3株微藻對(duì)重金屬和抗生素的抗性進(jìn)行比較，以期為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的綠囊藻（XLDB3）、Marvania（XLDB12）和小球藻（XLDB9）是新疆大學(xué)植物生物技術(shù)校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物細(xì)胞研究室從新疆富蘊(yùn)縣荒漠樣本中分離純化而得到的。藻株的培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)度為800～2 000 Lux，溫度為18～26 ℃，明暗周期為18 h∶8 h。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各操作步驟均進(jìn)行滅菌處理（120 ℃，30 min）。

1.2 試驗(yàn)試劑

HgCl2、CdCl2·2.5H2O、PbCl2為國(guó)產(chǎn)藥品，用雙重水定容至0.05 mol/L母液，存于容量瓶中備用。氨芐青霉素鈉鹽和四環(huán)素鹽酸鹽分別用雙重水定容至100和10 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，鏈霉素硫酸鹽用無(wú)水乙醇定容至50 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 3種藻類生長(zhǎng)的測(cè)定。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞并接種新配制的BBM液體培養(yǎng)基，接種量為4.7×104個(gè)/ml，每天人工搖1～2次。每天定時(shí)取樣測(cè)定650 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.3.2 3種藻類的細(xì)胞形態(tài)觀察。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液取1 ml加入NaN3抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，制備切片用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。制備切片[8]利用透射電鏡觀察細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 3種藻類的抗重金屬特性檢測(cè)。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種重金屬離子的母液（用針頭過(guò)濾器過(guò)濾），配制成的汞離子濃度分別為0.000 5、0.001 0、0.003 0、0.005 0、0.010 0 mmol/L，鉛離子的濃度分別為 0.3、0.4、05、0.6、0.8、1.0 mmol//L，鎘離子的濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。以不加重金屬的空白組作為對(duì)照，3種藻株以4.7×104個(gè)/ml的接種量接入上述含不同濃度重金屬的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)梯度3 個(gè)平行組，每天人工搖1～2次。每天定時(shí)取樣測(cè)定650 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.3.4 3種品系的抗生素抗性檢測(cè)。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種抗生素，配成的氨芐青霉素濃度分別為40、45、50、55、60、100、250、500、1 000 μg/ml，四環(huán)素濃度分別為

2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，鏈霉素濃度分別為1、2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，以萊茵衣野生型

品系CC124作對(duì)照。4種藻株按4.7×104個(gè)/ml接種量接入含不同濃度抗生素的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)梯度3 個(gè)平行組。每天人工搖1～2次，觀察細(xì)胞是否生長(zhǎng)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析。

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行分析。用Excel作圖。

2 結(jié)果

2.1 3種藻株的生長(zhǎng)曲線

圖1表示了XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株品系的生長(zhǎng)情況。從圖1可知，3株品系在第4天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第10天由對(duì)數(shù)期末期轉(zhuǎn)入了衰亡期，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)穩(wěn)定期，該3株品系的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。

圖1 3種品系的生長(zhǎng)曲線

2.2 3株品系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

由圖2可知，品系XLDB3的細(xì)胞是球形，細(xì)胞體大；亞顯微結(jié)構(gòu)很特殊，細(xì)胞的核區(qū)很明顯，核區(qū)周圍可以看出淀粉粒，細(xì)胞壁不厚，沒(méi)有發(fā)達(dá)的液泡。品系XLDB9的細(xì)胞是球形，與品系XLDB3相比，細(xì)胞體很小，細(xì)胞內(nèi)有較大的液泡。該品系的細(xì)胞壁很厚，葉綠體很明顯，液泡系特別發(fā)達(dá)。品系XLDB12的細(xì)胞也是球形，與品系XLDB3相比，細(xì)胞體很小，細(xì)胞壁很厚，核區(qū)很明顯。

2.3 3株品系的重金屬抗性檢測(cè)

2.3.1 Hg2+對(duì)3株品系生長(zhǎng)的影響。

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3株微藻的吸光值不斷增加，但試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)隨著（ Hg2+）的增加，吸光值不斷降低，6 d后更明顯（P<005）。藻株XLDB3和XLDB9在5種濃度組[ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異顯著（P<005），高濃度組 [0.003 mmol/L≤ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L] 的藻細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停止，說(shuō)明5種濃度的Hg2+抑制該2株品系的生長(zhǎng)，ρ（Hg2+）≥0.005 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB3的死亡，ρ（Hg2+）≥0.003 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB9的死亡。藻株XLDB12低濃度組[ρ（Hg2+）≤0005 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著（P>005）；高濃度組[ρ（Hg2+）=0.010 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎停止了生長(zhǎng)，說(shuō)明ρ（Hg2+）≤0050 mmol/L的Hg2+對(duì)該品系生長(zhǎng)的抑制不明顯，XLDB12對(duì)0.050 mmol/L的Hg2+有抗性。XLDB12對(duì)金屬Hg2+的抗性高于XLDB3和XLDB9，XLDB12對(duì)Hg2+的抗性達(dá)到0.050 mmol/L。

43卷15期 祖路皮亞·載買爾等 新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

2.3.2 Pb2+對(duì)3種藻株生長(zhǎng)的影響。

由圖4可知，Pb2+對(duì)3種微藻生長(zhǎng)的影響與Hg2+不相同。XLDB3在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對(duì)照組，4 d后高濃度組[ρ（Pb2+）=1.0 mmol/L]的吸光值不斷降低，藻細(xì)胞幾乎死亡，說(shuō)明ρ（Pb2+）≤0.8 mmol/L的Pb2+促進(jìn)XLDB3的生長(zhǎng)，1.0 mmol/L 的Pb2+導(dǎo)致該品系的死亡，因此，XLDB3對(duì)Pb2+抗性達(dá)到0.8 mmol/L。前4 d內(nèi)XLDB9和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對(duì)照組，4 d后XLDB9高濃度組[ρ（Pb2+）>0.4 mmol/L]的吸光值和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細(xì)胞幾乎死亡，說(shuō)明前4 d內(nèi)5種濃度的Pb2+促進(jìn)XLDB9和XLDB12的生長(zhǎng)，4 d后0.3和0.4 mmol/L濃度下XLDB9的藻細(xì)胞仍然生長(zhǎng)，其他濃度組的生長(zhǎng)受到抑制，而XLDB12在5種濃度的生長(zhǎng)都受強(qiáng)烈的抑制，最后都死亡。因此，XLDB9對(duì)Pb2+抗性達(dá)到0.4 mmol/L。XLDB3

2.3.3 Cd2+對(duì)3種藻株生長(zhǎng)的影響。

由圖5可知，前4 d內(nèi)XLDB3和XLDB12在5種濃度組的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），4 d后該2株藻高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細(xì)胞幾乎死亡，說(shuō)明前4 d內(nèi)5種濃度的Cd2+對(duì)該2種品系生長(zhǎng)的影響不明顯，4 d后高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，到第6天細(xì)胞死亡，因此，XLDB3和XLDB12對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L。在10 d內(nèi)，XLDB9低濃度組[ρ（Cd2+）≤0.05 mmol/L]的吸光值與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），而高濃度組[ρ（Cd2+）≥010 mmol/L] 的吸光值與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），第4天高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎死亡，說(shuō)明高濃度組的Cd2+強(qiáng)烈抑制該品系的生長(zhǎng)，XLDB9對(duì)Cd2+的抗性也達(dá)到0.05 mmol/L。3株品系對(duì)Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L，其中XLDB3的抗性較強(qiáng)。

2.4 3株品系的抗生素抗性檢測(cè)

2.4.1 氨芐青霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

從表1可知，氨芐青霉素濃度為40～1 000 μg/ml時(shí)，4株品系都能正常生長(zhǎng)，它們對(duì)氨芐青霉素的抗性均達(dá)到1 000 μg/ml，其中XLDB12的抗性最強(qiáng)。

2.4.2 四環(huán)素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

從表2可知，四環(huán)素濃度為2.5～60 μg/ml時(shí)，XLDB3和對(duì)照CC124在最高濃度中正常生長(zhǎng)，而XLDB9和XLDB12能生長(zhǎng)的最高濃度是40 μg/ml。因此，該4株品系中CC124對(duì)四環(huán)素的抗性較強(qiáng)，已達(dá)到60 μg/ml。

2.4.3 鏈霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響。

從表3可知，鏈霉素濃度為1～60 μg/ml時(shí)，對(duì)照CC124和XLDB3能生長(zhǎng)的最高鏈霉素濃度為40 μg/ml，而XLDB9和XLDB12只能生長(zhǎng)在1和2.5 μg/ml濃度中。該4株品系之中CC124對(duì)鏈霉素的抗性較強(qiáng)，已達(dá)到40 μg/ml。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)該試驗(yàn)可知，3株微藻對(duì)Hg2+和Pb2+的抗性存在較大的差別，它們對(duì)Hg2+的抗性大小順序?yàn)閄LDB12>XLDB3>XLDB9，對(duì)Pb2+的抗性大小順序?yàn)閄LDB3>XLDB9>XLDB12，對(duì)Cd2+的抗性基本一致。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素對(duì)3株微藻品系和對(duì)照CC124的生長(zhǎng)均沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)氨芐青霉素濃度在40～1 000 μg/ml之間變化時(shí)，4株品系均具有抗性，抗性大小順序?yàn)閄LDB12> XLDB9> CC124> XLDB3。四環(huán)素對(duì)XLDB3和對(duì)照CC124生長(zhǎng)的影響不明顯，該兩株品系對(duì)四環(huán)素均具有抗性，而四環(huán)素對(duì)XLDB9和XLDB12生長(zhǎng)的影響較明顯，當(dāng)濃度為2.5～40 μg/ml時(shí)，該2株微藻均有較弱的抗性，濃度到45 μg/ml時(shí)細(xì)胞就死亡，它們的抗性大小順序?yàn)镃C124> XLDB3> XLDB12 > XLDB9。鏈霉素對(duì)4株品系生長(zhǎng)的影響很明顯，當(dāng)濃度為1～40 μg/ml時(shí)，XLDB3和CC124均有較強(qiáng)的抗性，濃度到45 μg/ml時(shí)細(xì)胞死亡，而鏈霉素濃度為5 μg/ml時(shí)，XLDB9和XLDB12都死亡，它們的抗性大小順序?yàn)镃C124> XLDB3>XLDB9> XLDB12。

由于藻類細(xì)胞表面具有與重金屬離子結(jié)合的帶負(fù)電荷的官能團(tuán)，使其在藻細(xì)胞的表面和內(nèi)部沉積，因此，抑制藻類生長(zhǎng)的主要原因被認(rèn)為是重金屬離子與藻類的親和性，并且親和性越強(qiáng)毒性越大[9]。藻細(xì)胞可以有效降低重金屬離子對(duì)本身的脅迫作用，但隨著重金屬濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，微藻的正常生理功能受到嚴(yán)重傷害，從而逐漸喪失了對(duì)脅迫的調(diào)節(jié)能力[10]。

抗生素對(duì)藻細(xì)胞的作用是多方面的，抗生素對(duì)藻體本身有直接的作用，既可能抑制藻類的生長(zhǎng)，又可能在特定濃度時(shí)刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧在低濃度范圍內(nèi)的增多，從而促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)。不同抗生素的作用機(jī)理是各不相同的。

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