5種精油和多抗霉素對(duì)黃瓜枯萎病原菌抑菌活性的研究

潘彥彪　田永強(qiáng)　張阿強(qiáng)等

摘要 [目的]研究百里香等5種精油對(duì)黃瓜枯萎病原菌的抑菌效果，以及篩選出的優(yōu)選精油和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果。[方法]采用菌絲生長(zhǎng)速率法篩選抑菌效果最強(qiáng)的精油，并檢測(cè)其最小抑菌濃度（MIC）和EC50，同時(shí)研究?jī)?yōu)選精油和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果。[結(jié)果]精油中百里香的抑制效果最強(qiáng)，EC50為0.309 μl/ml，MIC為0.530 μl/ml。百里香精油和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果明顯大于兩者的單一抑菌效果。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為天然藥物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黃瓜枯萎??；精油；百里香精油；多抗霉素；抑菌活性

中圖分類號(hào) S436.421.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-117-04

Research on Antifungal Activities of Five Different Kinds of Essential Oil against Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen

PAN Yanbiao， TIAN Yongqiang*， ZHANG Aqiang et al

（School of Chemical and Biological Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To study the bacteriostasis effects on Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen which the five different kinds of essential oil have， such as thyme oil etc， and the coordination bacteriostasis effects of the selective preference essential oil and the polyoxin. [Method] Screening the essential oil which has the best bacteriostasis effect by growth rate method and check its MIC and EC50. A comparative study on the coordination bacteriostasis effects of essential oil and the polyoxin was conducted. [Result] The bacteriostasis effect of the thyme oil is the best among others. Its EC50 was 0.309 μl/ml and the MIC was 0.530 μl/ml. Obviously， the coordination bacteriostasis effect of the thyme oil and the polyoxin is better than any one of this two alone. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of natural medicine pesticide.

Key words Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen； Essential oil； Thyme oil； Polyoxin； Antifungal activities

目前化學(xué)農(nóng)藥殘留已成為危害人類健康的最大殺手之一，長(zhǎng)期食用能誘發(fā)癌癥等多種疾病。天然藥物農(nóng)藥被稱為綠色農(nóng)藥，其種類的多樣性、抑菌的光譜性、對(duì)人體的超低危害性決定了其作為新一代農(nóng)藥的優(yōu)勢(shì)[1-5]。筆者采用菌絲生長(zhǎng)速率法研究了5種精油對(duì)黃瓜枯萎病原菌的抑菌活性，測(cè)定了優(yōu)選精油的MIC和EC50，并研究了該優(yōu)選精油和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果，旨在為天然藥物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試驗(yàn)材料。百里香精油、桉葉精油、連翹精油、艾葉精油、薄荷精油、多抗霉素均購(gòu)自化工有限公司；黃瓜枯萎病原菌，土豆，葡萄糖，瓊脂。

1.1.2 儀器。

LDZX50FA立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SWCJ2FD無(wú)菌操作臺(tái)（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司）、MJ250I霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、YP1002N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物的配制。

1.2.1.1 精油使用液的配制。以無(wú)水乙醇和吐溫80溶解待測(cè)精油，無(wú)水乙醇用量為1 ml，吐溫80用量為10 μl，待測(cè)精油用量依據(jù)試驗(yàn)情況而定。

1.2.1.2 多抗霉素使用液的配制。用無(wú)菌蒸餾水溶解多抗霉素得到濃度為0.1 g/ml的多抗霉素溶液，待測(cè)多抗霉素用量依據(jù)試驗(yàn)情況而定。

用0.22 μm微孔濾膜對(duì)上述混合液抽濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 抑菌率的測(cè)定。

1.2.2.1 藥物的初篩。使用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定薄荷、連翹、桉葉、艾葉和百里香的抑菌活性。取5種精油使用液且精油用量相同，在無(wú)菌條件下加入250 ml已滅菌的三角瓶中，再加入99 ml已滅菌并冷卻到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基，充分搖勻后倒入4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿25 ml。以等量的乙醇-吐溫80混合液加入培養(yǎng)基為空白對(duì)照。以青枯立克為陽(yáng)性對(duì)照，按照上述方法配制成2.0 μl/ml的含藥培養(yǎng)基。用10 mm打孔器在培養(yǎng)7 d的供試菌菌落邊緣打取長(zhǎng)勢(shì)相同的菌餅，接入上述各平板中，每板中央各1枚，菌餅周圍要光滑，接菌餅時(shí)菌餅在培養(yǎng)基上如有滑動(dòng)則該平板廢棄，菌餅有菌絲的一面朝下。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在 96、120和144 h后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算精油對(duì)菌絲的抑制率。首次篩選采用大幅度濃度梯度，再根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果縮小濃度范圍，直到待測(cè)精油中有1種或2種有明顯抑菌效果，而其他精油無(wú)明顯抑菌效果時(shí)的濃度為最終測(cè)試濃度[6-8]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.2.2.2 優(yōu)選藥物不同濃度的抑菌活性測(cè)定。

通過(guò)“1.2.2.1”選取抑菌活性最強(qiáng)的精油，進(jìn)行濃度梯度測(cè)定。配制精油使用液且精油含量分別為90、80、70、60、50、40、30、20和10 μl的濃度梯度。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.3 不同濃度多抗霉素的抑菌活性測(cè)定。

配制多抗霉素使用液含量分別為10、20、50、100、200 mg的濃度梯度。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定，方法同“1.2.2.1”[9]。

1.2.2.4 優(yōu)選藥物和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果。將優(yōu)選精油和多抗霉素進(jìn)行復(fù)配測(cè)試，方法同“1.2.2.1”[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物的初篩 通過(guò)藥物初篩的濃度梯度測(cè)試，最終確定測(cè)試濃度為精油在含藥培養(yǎng)基中的濃度是1.0 μl/ml。

由表1和圖1可知，在1.0 μl/ml濃度下5種精油中連翹精油對(duì)黃瓜枯萎病原菌的抑制效果最差，并且表現(xiàn)出輕微的促進(jìn)效果。桉葉的抑制率在10%左右，抑菌效果可以忽略。艾葉精油的抑制率明顯低于薄荷精油和百里香精油。薄荷精油96 h時(shí)的抑菌率高達(dá)9000%，但是在144 h時(shí)卻降到81.65%，明顯低于百里香精油連續(xù)3個(gè)檢測(cè)時(shí)間段的100%的抑制率。從整體來(lái)看，百里香精油的抑菌效果最好，薄荷精油次之，艾葉精油的抑菌效果不明顯，桉葉精油和連翹精油沒(méi)有抑菌效果。另外，桉葉、艾葉和薄荷精油的抑菌效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，由于百里香精油在3個(gè)檢測(cè)時(shí)間段的抑菌效果都是100%，因此可以判斷百里香精油濃度為10 μl/ml時(shí)并不一定是對(duì)黃瓜枯萎病原菌毒性抑制的MIC，還需對(duì)百里香進(jìn)行進(jìn)一步的濃度梯度毒力檢測(cè)[10-11]。

2.2 優(yōu)選藥物不同濃度的抑菌活性

根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算出

百里香精油毒力方程為y=2.262 4x-0.199 3，r=0.985 8，百里香精油對(duì)黃瓜枯萎病原菌的EC50為0.309 μl/ml，MIC為0.530 μl/ml。由圖2可知，百里香精油濃度大于0.3 μl/ml時(shí)對(duì)黃瓜枯萎病原菌有明顯的抑制作用，且抑菌效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，所測(cè)濃度梯度存在顯著性差異[12-14]。

2.3 抗生素多抗霉素不同濃度的抑菌活性

根據(jù)表3數(shù)據(jù)計(jì)算出多抗霉素毒力方程為y=0.051 9x+0.187 1，r=0.992 9，多抗霉素對(duì)黃瓜枯萎病原菌的EC50為6.029 0 mg/ml，MIC為15.662 8 mg/ml。由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌效果有明顯的下降趨勢(shì)，所測(cè)濃度梯度的顯著性差異不明顯。

2.4 百里香和多抗霉素的協(xié)同抑菌活性

2.4.1 0.2 μl/ml百里香和不同濃度多抗霉素的協(xié)同抑菌活性。由表4和圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，百里香和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果有下降趨勢(shì)。結(jié)合表3和圖3可知，在無(wú)百里香的情況下，多抗霉素各濃度梯度的抑菌效果無(wú)顯著性差異，而添加0.2 μl/ml百里香精油之后，各濃度梯度的抑菌效果有顯著性差異。

2.4.2 0.1 μl/ml百里香和不同濃度多抗霉素的協(xié)同抑菌活性。由表5和圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，百里香和多抗霉素的協(xié)同抑菌效果有下降趨勢(shì)。參照表3和圖3可知，在無(wú)百里香的情況下，多抗霉素各濃度梯度的抑菌效果無(wú)顯著性差異，而添加0.1 μl/ml百里香精油之后，各濃度梯度間存在顯著性差異。

注：不同大、小寫字母分別表示處理間在0.01、0.05水平差異顯著。

圖2 百里香不同濃度對(duì)黃瓜枯萎病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率變化趨勢(shì)

2.5 百里香同多抗霉素的協(xié)同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對(duì)比

2.5.1 百里香同多抗霉素的協(xié)同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對(duì)比（百里香濃度為0.2 μl/ml）。由表6和圖6可知，百里香同多抗霉素的協(xié)同抑菌效果和百里香、多抗霉素的單一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。以96 h時(shí)百里香濃度為0.2 μl/ml、多抗霉素濃度為2.0 mg/ml為例，百里香和多抗霉素的抑菌率分別為35.06%和45.62%，而兩者的協(xié)同抑菌效果達(dá)到96.00%。同單一抑制

增加了15.32%，同樣，在添加了百里香的情況下協(xié)同效果較多抗霉素單一情況下增加了50.38%，比百里香單一抑菌效果（35.06%）增加了15.32%，充分體現(xiàn)出1+1﹥2的協(xié)同抑菌優(yōu)勢(shì)。

2.5.2 百里香同多抗霉素的協(xié)同抑菌效果和百里香、多抗霉素單一抑菌效果的對(duì)比（百里香濃度為0.1 μl/ml）。由表7和圖7可知，百里香同多抗霉素的協(xié)同抑菌效果和百里香、多抗霉素的單一抑菌效果相比，抑菌率大幅度增加。

3 結(jié)論

5種精油對(duì)黃瓜枯萎病原菌抑菌效果大小為：百里香>薄荷>艾葉>桉葉>連翹。其中百里香抑菌效果最強(qiáng)，其各濃度間有顯著性差異，表明在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，濃度變化對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較大。在百里香和多抗霉素的協(xié)同抑制中，兩者的混合抑制效果明顯大于各單一抑制效果，在百里香精油濃度為0.1 μl/ml時(shí)，百里香對(duì)黃瓜枯萎病原菌的抑制效果小于5%，已經(jīng)沒(méi)有明顯抑制效果，但是在加入多抗霉素后，卻有著較明顯的抑制效果，與單一抑制效果相比，抑菌率有

了大幅度增加。

參考文獻(xiàn)

[1]

余俐佳.十萬(wàn)大山 25 種植物抑菌除草活性篩選[D].南寧：廣西大學(xué)，2012.

[2] 胡仁火，任國(guó)祥.9種中藥植物抑菌作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（27）：8534-8535.

[3] 郭俊華.功能性植物抑菌沐浴液的研制[J].中國(guó)洗滌用品工業(yè)，2012 （5）：69-71.

[4] 錢昆，周濤.復(fù)配植物抑菌物的超臨界萃取及其抑菌特性研究[J].食品科學(xué)，2007，27（11）：369-372.

[5] 韓建華，祝木金，馮俊濤，等.27 種植物抑菌活性初步篩選[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，30（6）：134-137.

[6] 肖莉春.29 種中藥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及對(duì)耐藥大腸桿菌抑菌活性研究[D].南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[7] 賴毅東.具有抑菌活性成分中草藥的篩選及防腐保鮮應(yīng)用機(jī)理研究 [D].廣州：華南理工大學(xué)，2003.

[8] 李國(guó)林，張忠，畢陽(yáng)，等.八種植物精油體外抑菌效果的比較[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：130-133.

[9] 李孫洋，邱其偉，劉興元，等.12 種藥用植物粗提物對(duì) 4 種植物病原真菌抑菌活性研究[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2014，34（1）：5-9.

[10] 黃聰華.芒萁抑菌有效成分的提取及抑菌機(jī)理研究[D].廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2013.

[11] 殷帥文，王慶先，聶森，等.狗脊蕨等 10 種植物提取物抑菌活性的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：88-89.

[12] 劉光明，張俊冬，梁瑞，等.檢測(cè)杜仲，連翹，大蒜和生姜 4 種藥用植物的抑菌效果[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，6（3）：241-243.

[13] 丁芬，王亞茹.狼爪瓦松粗提物抑菌效果研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2013，26（2）：227-228.

[14] 王占斌，彭巍，蔡紀(jì)文，等.兩種植物抑菌物質(zhì)的提取及其抑菌效果測(cè)定[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（2）：329-331.