楊廷佳 劉金晨 石寶蘭 張 偉 王 浩 李婷婷 趙 娟 沈海峰 周 揚(yáng)

(國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司,江蘇揚(yáng)州 225127)

禽流感細(xì)胞滅活疫苗（H9亞型，F(xiàn)株）安全性研究

楊廷佳 劉金晨 石寶蘭 張 偉 王 浩 李婷婷 趙 娟 沈海峰 周 揚(yáng)

(國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司,江蘇揚(yáng)州 225127)

將實(shí)驗(yàn)室試制的禽流感細(xì)胞滅活疫苗(H9亞型,F株) (批號(hào):201201、201202)通過(guò)頸部皮下注射的方式單劑量、單劑量重復(fù)、超劑量接種10日齡SPF雞進(jìn)行安全性試驗(yàn)。免疫后連續(xù)監(jiān)測(cè)15天,每周稱重,用t檢驗(yàn)分析對(duì)照組和免疫組體重之間的差異顯著性。試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫接種組和空白對(duì)照組體重差異不顯著,所制備的禽流感細(xì)胞滅活疫苗(H9亞型,F株)不影響雞的生長(zhǎng)性能,安全性良好。

禽流感;細(xì)胞滅活疫苗;安全性試驗(yàn)

以H9亞型AIV為代表的LPAI所引起的發(fā)病癥狀主要以呼吸系統(tǒng)疾病表現(xiàn)為主，但可能被混合感染和繼發(fā)感染其他病原或環(huán)境條件等因素所惡化，給養(yǎng)禽業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。針對(duì)我國(guó)現(xiàn)流行情況，H9禽流感全病毒滅活疫苗被廣泛的用于家禽中，但滅活疫苗有容易引起過(guò)敏反應(yīng)、注射部位易引發(fā)炎癥等諸多缺點(diǎn)[3，4]。因此，安全性是任何一種生物制品在使用前必須具備的前提條件，為確定實(shí)驗(yàn)室試制的禽流感細(xì)胞滅活疫苗（H9亞型，F(xiàn)株）對(duì)雞的安全性，特開展本試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞 SPF雞蛋購(gòu)自北京梅里亞維通生物技術(shù)有限公司，自行孵化，在相對(duì)隔離的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)疫苗 禽流感細(xì)胞滅活疫苗（H9亞型，F(xiàn)株），由國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司試制，批號(hào)：201201、201202。

1.2 方法

1.2.1 物理性狀檢驗(yàn)

劑型 在玻璃燒杯內(nèi)盛入2/3自來(lái)水或蒸餾水（22～25℃），靜止。用1 ml吸管分別吸取疫苗0.4 ml，垂直緩慢滴于液面上，觀察疫苗在水中的變化情況。

粘度 在室溫條件下（22～25℃），用內(nèi)徑2.7 mm，出口內(nèi)徑1.2 mm的1 ml吸管，分別吸取各批疫苗樣品1 ml，吸管垂直，使疫苗自然流出，計(jì)算放出0.4 ml疫苗所需的時(shí)間。

穩(wěn)定性 分別取各批疫苗樣品約10 ml，以3000 r/min離心15分鐘，觀察疫苗分層及水相析出情況。

1.2.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄作無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.2.3 甲醛含量測(cè)定 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)定甲醛含量。

1.2.4 單劑量一次接種安全性試驗(yàn)

將10日齡的SPF雞隨機(jī)分為3組，每組10只，第1、2組以頸部皮下注射的方式接種疫苗0.2 ml，第3組不免疫作為陰性對(duì)照，頸部皮下注射生理鹽水0.2 ml。疫苗免疫后，每周測(cè)定雞的體重，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析數(shù)據(jù)，若P＞0.05則說(shuō)明體重之間沒有顯著差異，若P≤0.05則說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異。若接種疫苗組雞的體重明顯高于或低于對(duì)照組雞，則說(shuō)明疫苗不安全；若接種疫苗組雞和對(duì)照組雞的體重差不顯著，則說(shuō)明疫苗安全。連續(xù)觀察15天，記錄疫苗接種部位和全身的臨床反應(yīng)，然后剖殺所有雞，重點(diǎn)檢查注射部位的病變。

1.2.5 單劑量重復(fù)接種安全性試驗(yàn)

試驗(yàn)方法同1.2.4，免疫接種2周后，再重復(fù)接種一次，每天觀察各組雞是否出現(xiàn)全身癥狀，同時(shí)每周測(cè)定雞的體重。連續(xù)觀察15天后剖殺所有雞，重點(diǎn)檢查注射部位的組織病變。

1.2.6 超劑量一次接種安全性試驗(yàn)法

試驗(yàn)分組同1.2.4，試驗(yàn)組每只頸部皮下接種疫苗1 ml（5倍單劑量），每天觀察各組雞是否出現(xiàn)全身癥狀，同時(shí)每周測(cè)定雞的體重。連續(xù)觀察15天后剖殺所有雞，重點(diǎn)檢查注射部位的組織病變。

2 結(jié)果與討論

2.1 物理性狀檢驗(yàn) 結(jié)果見表1。

外觀 為乳白色乳劑。

劑型 疫苗滴于冷水中，呈油滴狀不擴(kuò)散，為油包水型（W/O型）。

穩(wěn)定性 以3000 r/min離心15分鐘，疫苗無(wú)分層現(xiàn)象，水相析出＜0.5 ml；在37 ℃左右條件下放置21日，未破乳。

粘度 疫苗垂直自然流出0.4 ml所需時(shí)間均小于8s鐘，符合規(guī)定。

2.2 無(wú)菌檢驗(yàn)

三批疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)均無(wú)菌生長(zhǎng)，符合規(guī)定。

2.3 甲醛含量測(cè)定

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，符合規(guī)定。

表1 疫苗成品檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 單劑量一次、單劑量重復(fù)接種安全性試驗(yàn)

免疫后實(shí)驗(yàn)雞精神、飲食飲水狀況正常，羽毛有光澤，叫聲響亮，未發(fā)現(xiàn)因注射疫苗后引起的局部及全身不良反應(yīng)，15天后逐只進(jìn)行剖檢，注射局部組織未見有明顯的肉芽腫脹。單劑量重復(fù)接種疫苗后，試驗(yàn)雞均沒有任何臨床癥狀和全身不良反應(yīng)。剖解，僅個(gè)別SPF雞注射部位殘存少量疫苗，但并沒有對(duì)組織造成的明顯的損傷。疫苗免疫對(duì)試驗(yàn)雞的體重增長(zhǎng)影響試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），免疫組和對(duì)照組的體重基本一致，差異不顯著（P＞0.05），因此疫苗的接種并不影響試驗(yàn)雞的體重增長(zhǎng)，安全性良好，證明實(shí)驗(yàn)室試制的疫苗是安全的，可用于雞的免疫。

2.5 超劑量一次接種安全性試驗(yàn)

超劑量一次注射（5倍正常使用劑量）后，初期SPF雞都表現(xiàn)出輕微的臨床癥狀，與對(duì)照雞相比，飲食量基本正常、精神稍差，喜臥，之后恢復(fù)正常，都沒有出現(xiàn)死亡，2～3d癥狀逐漸消失，精神飲食恢復(fù)正常。15天后剖殺，在注射部位均殘存有一定量的疫苗，并沿頸部皮下有遷移現(xiàn)象，但注射部位沒有出現(xiàn)出血和水腫癥狀。疫苗免疫對(duì)雞的體重增長(zhǎng)影響試驗(yàn)結(jié)果見表3，免疫組和對(duì)照組的體重差異不顯著（P＞0.05），疫苗的接種并不影響實(shí)驗(yàn)雞的體重的增長(zhǎng)。

表2 單劑量一次、單劑量重復(fù)接種SPF雞平均體重統(tǒng)計(jì)

表3 超劑量一次接種SPF雞平均體重統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在進(jìn)行安全檢驗(yàn)時(shí)，分別進(jìn)行了單劑量、單劑量重復(fù)、超劑量接種，免疫后，不管是接種的局部，還是免疫組雞的全身，均無(wú)臨床反應(yīng)。超劑量接種造成試驗(yàn)雞在注射初期表現(xiàn)出一定的臨床癥狀，其原因可能是由于雞只過(guò)小或注射劑量過(guò)大，刺激注射局部腫脹、疼痛，導(dǎo)致精神稍差，并非疫苗毒性所致的全身反應(yīng)。接種后每周檢測(cè)試驗(yàn)雞體重，接種組和對(duì)照組的體重均不存在顯著差異，試驗(yàn)結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)室試制的禽流感細(xì)胞滅活疫苗（H9亞型，F(xiàn)株）是安全的，制苗工藝是合理的。

[1] Kishida N，Sakoda Y Eto M，Sunaga Y，Kida H．Co-infection of Staphylococcus aureus or Haemophilus paragallinarum exacerbates H9N2 influenza A virus infection in chickens[J]．Arch Virol，2004，149（11）：2095-2104．

[2] 萬(wàn)曉朋，曾顯營(yíng)，田國(guó)彬.H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（4）：276-280.

[3] 李新生，陳紅英，黃宗梅，等.雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9N2）三聯(lián)滅活疫苗的安全性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，（7）：1671-7236.

[4] 劉淑紅，焦鐵軍，李河林，等.雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗的安全性和免疫效力試驗(yàn)[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47（2）：14-17.