HPLC-ELSD法測定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陳良勝 方應(yīng)權(quán)

HPLC-ELSD法測定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陳良勝 方應(yīng)權(quán)

目的測定大別山不同海拔高度桔梗藥材的桔梗皂苷的含量, 為評價其質(zhì)量品質(zhì)提供理論依據(jù)。方法采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法, KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫；流速0.4 ml/min。結(jié)果1000 m海拔高度以上地區(qū)桔梗藥材的皂苷含量差異性顯著, 700 m高度以下地區(qū)桔梗皂苷含量無顯著差異。結(jié)論桔梗皂苷的含量可能受陽光、氣溫等外在因子影響而發(fā)生變化, 為有效控制桔梗藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

桔梗；海拔高度；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器； 含量測定

桔梗(Radix Platycodi)為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.的干燥根, 在我國藥用歷史悠久, 具有宣肺、利咽、祛痰和排膿之效［1-3］。桔梗中主要成分是桔梗皂苷,現(xiàn)代藥理研究試驗表明：桔梗中的主要活性物質(zhì)桔?？傇碥站哂袕V泛的生物活性, 在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、祛痰、保肝、降膽固醇、降血脂等方面的藥理活性引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。桔梗在大別山均有種植, 氣候適宜, 病蟲害較少, 栽培技術(shù)成熟, 地形復(fù)雜且變化多樣, 各個海拔高度都有, 從丘陵到高山, 海拔高差大, 立體氣候明顯。本實驗采用HPLC-ELSD法, 桔梗對照品桔梗皂苷D, 測定不同海拔高度的桔梗皂苷含量, 探索海拔高度對桔梗藥材的質(zhì)量的影響, 以期為桔梗藥材的質(zhì)量評價提供可靠的科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 AGILENT 1100 LC 高效液相色譜儀(美國)；AGILENT CHEMSTAT ION 工作站(美國安捷倫科技公司)；檢測器：AGILENT DAD；色譜柱：Phenomenex-C18柱(250 mm×4.6 mm, 粒度5 μm；迪馬公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；梅特勒ME215S十萬分之一電子天平; 梅特勒CP224S萬分之一電子天平；超聲波清洗儀SD3200 (昆山市超聲儀器有限公司)；LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機。

1.1.2 試藥 桔梗皂苷D對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號為：111851-201204, 含量94.9%)；乙腈：色譜純；甲醇,甲酸∶分析純(川東化工集團有限公司化學(xué)試劑廠)；超純水 (自制)。桔梗藥材樣品采自大別山區(qū)雞公山不同海拔高度,見表1。共12批, 同一海拔地區(qū)橫向間隔100～150 m采一次樣, 將12批樣混合均勻, 粉粹干燥至恒重備用。并經(jīng)重慶萬州食品藥品檢驗所方應(yīng)權(quán)教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodon grandiflorμm(Jacq.)A.DC.的根。

1.2 方法［4-6］

1.2.1 色譜條件 色譜柱：KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動相：流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫。見表1。流速：0.4 ml/min；進樣量：20 μl。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定桔梗皂苷D對照品5.65 mg, 置于10 ml量瓶中, 加50%甲醇稀釋至刻度, 過0.45 μm微孔濾膜濾過即得, 進樣20 μl。見圖1。

圖1 桔梗皂苷D對照品色譜圖

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取桔梗藥材粉末(過二號篩)精密稱定2 g, 置錐形瓶中, 精密加入50 %甲醇25 ml, 超聲提取30 min, 放冷, 再稱定重量, 用50 %甲醇補足重量, 濾過,取續(xù)濾液, 過0.45 μm微孔濾膜濾過即得, 進樣20 μl。見圖2。

圖2 桔梗藥材樣品色譜圖

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標準曲線的繪制 精密吸取桔梗皂苷D標準品溶液 40、80、160、200、2400 μl, 置 10 ml 具塞磨口試管中,于水浴蒸發(fā)至干, 精密加10%香草醛試液 0.5 ml, 60% 硫酸 5 ml 搖勻, 于水浴加熱 15 min, 冰水浴中冷卻 3 min, 以同法平行處理的空白溶劑為空白, 在472 nm處測定吸光度。以標準品濃度C (μl/ml) 為橫坐標, 吸光度A為縱坐標繪制標準曲線, 得到回歸方程為: A=0.0034 C+0.0064, r=0.9997, 結(jié)果看出C在此濃度系列范圍內(nèi)與A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 精密度試驗 取同一批次桔梗樣品溶液, 按“2.1”項下條件連續(xù)進樣6次, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的相對標準偏差(RSD)值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明精密度良好。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批次桔梗樣品溶液共6份,按“2.1” 項下條件分別進樣20 μl, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明重復(fù)性良好。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批次桔梗樣品溶液, 分別在0、2、4、6、8、12、24 h檢測, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.3.5 加樣回收率實驗 準確稱取已知含量的桔梗藥材已干燥粉末6份, 每份0.05 g, 加入桔梗皂苷 D 適量, 按照上述方法制備樣品溶液, 各取20 μl樣品液, 測定吸光度, 計算回收率。平均加樣回收率為96.97%, RSD為1.51%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用DAS2.0藥物代謝動力學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

2 結(jié)果

依據(jù)方法“1.2”對不同海拔高度的12批次的桔梗皂苷含量測定。結(jié)果見表1。

表1 桔梗藥材藥品來源

3 小結(jié)

海拔高度對桔梗藥材成分影響較顯著, 700 m以下地區(qū)桔梗皂苷的含量無明顯差異, 較為接近, 700 m以上地區(qū)桔梗皂苷的含量出現(xiàn)明顯變化, 說明高海拔地區(qū)種植條件、產(chǎn)地對桔梗藥材產(chǎn)生影響。800 m以上地區(qū)陽光、氣溫等環(huán)境因素與低海拔丘陵山地地區(qū)出現(xiàn)較為大的變化。受到其他因素影響(氣候、土壤環(huán)境、采收時間等), 為保證桔梗藥材質(zhì)量的穩(wěn)定、可靠, 建議適宜的區(qū)域化種植。而桔梗皂苷含量與外在因子的相關(guān)性研究尚需進一步研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 259-260.

［2］李文庭, 祝明, 馬臨科, 等.桔梗的HPLC-ELSD指紋圖譜研究.中國實驗方劑學(xué)雜志, 2011, 17(22): 50-53.

［3］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同采收期桔梗 HPLC指紋圖譜比較研究. 中成藥, 2010, 32(3) : 353.

［4］楊海玲, 張振凌, 李俊雅, 等.河南省不同產(chǎn)區(qū)桔梗飲片 HPLC指紋圖譜研究. 河南科技, 2010(5): 66.

［5］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同產(chǎn)地桔梗藥材HPLC 指紋圖譜及桔梗皂苷D含量測定研究. 中成藥, 2010, 32(4) : 529.

［6］宋健, 王穎, 石俊英.山東地產(chǎn)藥材桔梗的HPLC指紋圖譜研究.中國現(xiàn)代中藥, 2011, 13(9): 21-23.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.183

2014-10-21］

465550 河南省新縣人民醫(yī)院(陳良勝)；重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校(方應(yīng)權(quán))

陳良勝