不同pH 條件下測(cè)定藏藥三果湯中沒食子酸、單寧酸、β-PGG 含量變化及分析

陳 平 左曉霜 華 杰 范 源

(1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500)

藏藥三果湯，又稱哲布松湯，由余甘子、訶子、毛訶子3味藥組成。最早見于《四部醫(yī)典》，記載三果湯“主治瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型”，即藏藥三果湯主清熱、調(diào)和氣血，用于瘟疫熱癥初期和后期、勞累過度所誘發(fā)的疾病［1］。此外，現(xiàn)代研究表明按照阿育吠陀傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論結(jié)合三果湯復(fù)方給藥對(duì)治療糖尿病有較好的效果［2-3］。在三果湯散處方配伍配比及用藥劑量上，印度傳統(tǒng)醫(yī)藥將訶子、毛訶子和余甘子3 種藥材的比例確定為l：1：1，而藏醫(yī)會(huì)根據(jù)臨床不同情況而調(diào)整比例［4］。目前，藥品消費(fèi)市場(chǎng)已有三果湯口服液、三果湯膠囊、三果湯顆粒劑、三果湯散劑等劑改產(chǎn)品上市銷售，對(duì)其處方制劑化學(xué)成分含量測(cè)定報(bào)道較少。三果湯中余甘子含有沒食子酸、單寧酸和β-PGG，特別是沒食子酸具有抗炎、抗菌等活性，與三果湯藥理作用一致，成為三果湯制劑質(zhì)控的有效指標(biāo)之一［5］。張海偉等［6］對(duì)超聲提取和回流提取進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同提取方法下沒食子酸等的含量差異不大。本實(shí)驗(yàn)采用不同pH 磷酸緩沖液超聲提取三果湯，運(yùn)用RP -HPLC 測(cè)定藏藥三果湯散中沒食子酸、單寧酸、β -PGG 的含量，以期為藏藥三果湯中成分的研究、藥效學(xué)研究、質(zhì)量控制等提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料：余甘子、毛訶子、訶子(購自安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司)。乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，丙酮(分析純)，乙醇(分析純)，磷酸氫二鈉(分析純)，磷酸(分析純)均購自云南丹赤貿(mào)易有限公司，純化水。β -PGG 標(biāo)準(zhǔn)品(購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：14021908)，沒食子酸(購自云南昆明中檢所，批號(hào)：110831 -201204)，單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品(購自成都邁斯g 醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：130721)

Agilent1200 型高效液相色譜儀(VWD 檢測(cè)器)、萬分之一分析天平(購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、D2KW-D 電熱恒溫水浴鍋、DFY - 600 搖擺式高速萬能粉碎機(jī)、雷磁PHS-3C pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 三果湯散的制備：依據(jù)衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)1995 版。訶子(去核)300g、毛訶子(去核)200g、余甘子(去核)240g分別打粉過3 號(hào)篩，混勻后過3 號(hào)篩，即得。

1.2.2 磷酸鹽緩沖液的配制：A 液：取磷酸16.6 mL，加純化水至1000 mL，搖勻。B 液：稱取磷酸氫二鈉71.63 g，加純化水使溶解成1000 mL。取上述A 液72.5 mL 與B液27.5 mL 混合配制，搖勻，即得pH = 2.00 的緩沖液。以pH = 2 的緩沖液為基本底液，再用純化水將其稀釋成pH 為3、4、5、6 、7 的緩沖液。

1.2.3 沒食子酸、單寧酸、β-PGG 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定沒食子酸對(duì)照品0.10mg，用50%甲醇制成10μg/mL的溶液，備用。精密稱取0.80 mg 單寧酸對(duì)照品，用乙醇、水、丙酮(70：29：1)溶液溶解并定容，制備成濃度為80μg/mL 的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密稱定β -PGG 對(duì)照品1.00mg，用甲醇制成100μg/mL 的溶液，備用。

1.2.4 沒食子酸、單寧酸、β-PGG 供試品溶液的制備：沒食子酸、單寧酸供試品溶液的制備：精密稱取0.1g 三果湯散，過3 號(hào)篩，置具塞錐形瓶中，分別制備6 份，精密加入不同pH 的磷酸緩沖液50mL，稱定重量，超聲30min(150W，40KHZ)，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm 濾膜過濾。即得。

β-PGG 供試品溶液的制備：精密稱取0.1g 三果湯散，過3 號(hào)篩，置具塞錐形瓶中，分別制備6 份，精密加入不同pH 的磷酸緩沖液50mL，超聲30min(150W，40KHZ)，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm 濾膜過濾。即得。

1.2.5 沒食子酸含量測(cè)定方法

1.2.5.1 沒食子酸色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);以甲醇-0.2%磷酸溶液(5：95)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長為273 nm;柱溫：25℃;進(jìn)樣量：10μL。

1.2.5.2 沒食子酸線性關(guān)系考察：精密稱取對(duì)照品0.10 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，搖勻作為儲(chǔ)備液搖勻作為儲(chǔ)備液。按上述沒食子酸色譜條件分別取3、5、7、9、11、13 μL 不同體積進(jìn)樣，以沒食子酸的峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，得方程y =2080.6x-3.4868，r=0.9998，結(jié)果表明：沒食子酸峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.03 -0.130μg。

1.2.6 單寧酸含量測(cè)定方法

1.2.6.1 單寧酸色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);以甲醇-水(80：20)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長為275 nm;柱溫：25℃;進(jìn)樣量：2.0μL。

1.2.6.2 單寧酸線性關(guān)系考察：精密稱取對(duì)照品0.60mg，用乙醇、水、丙酮(70：29：1)溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲(chǔ)備液。按上述單寧酸色譜條件分別取1、3、5、7、9、11 μL 不同體積進(jìn)樣，以單寧酸的峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，得方程y =3232.8x-15.412，r =0.9999。結(jié)果表明：?jiǎn)螌幩岱迕娣e值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.0 ～11.0μg。

1.2.7 β-PGG 含量測(cè)定方法

1.2.7.1 β-PGG 色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 柱(4.6 ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相：0min：乙腈-0.1%磷酸(10：90)，15 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75)，15.1 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75)，20 min：乙腈-0.1%磷酸(25：75);檢測(cè)波長為281 nm;柱溫：25℃;進(jìn)樣量：20μL。

1.2.7.2 β -PGG 線性關(guān)系考察：精密稱取對(duì)照品1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，搖勻作為儲(chǔ)備液搖勻作為儲(chǔ)備液。按上述沒食子酸色譜條件分別取13、15、17、19、21μL 不同體積進(jìn)樣，以β -PGG 的峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，得方程y =2195.0x -47.357，r=1.0。結(jié)果表明：PGG 峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.3 -2.1 μg。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：不同pH 條件下三果湯中沒食子酸、單寧酸、β-PGG 的含量：見表1、表2、表3。

圖1 不同pH 條件下三果湯中沒食子酸含量變化

圖2 不同pH 條件下三果湯中單寧酸含量變化

圖3 不同pH 條件下三果湯中β-PGG 含量變化

2.2 實(shí)驗(yàn)分析：當(dāng)pH 等于3 時(shí)，藏藥三果湯中沒食子酸含量最高，pH 等于2 ～6 時(shí)三果湯中沒食子酸含量變化不明顯，pH 等于6 ～7 時(shí)，三果湯中沒食子酸含量急劇下降到最低，如圖1;當(dāng)pH 等于3 時(shí)，三果湯中單寧酸含量最高，pH 等于3 ～7 時(shí)，三果湯中單寧酸含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中pH 等于5 時(shí)，單寧酸含量最低，如圖2;當(dāng)pH 等于2 ～5 時(shí)，三果湯中β-PGG 含量緩慢增長，當(dāng)pH 等于5時(shí)，三果湯中β-PGG 含量最高，pH 等于5 ～7 時(shí)，三果湯中的β-PGG 含量明顯下降，如圖3。三果湯中沒食子酸在pH 值為2 ～6 時(shí)含量變化較pH6 ～7 時(shí)含量變化小，推測(cè)沒食子酸在中性條件下較不穩(wěn)定，而對(duì)酸、強(qiáng)光、高溫較穩(wěn)定，在pH 值為2 ～6 的磷酸鹽緩沖液條件下能保持相對(duì)穩(wěn)定［7］。單寧酸是一類多酚類化合物，是沒食子酸酯及其衍生物與葡萄糖或多酚通過酯鍵相連形成的化合物，遇酸、堿、酶能夠水解，水解可生成雙沒食子酸酯等，能進(jìn)一步水解可生產(chǎn)成沒食子酸和葡萄糖等小分子化合物［8-9］。因此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中三果湯中的單寧酸在pH 等于5 時(shí)變化明顯可能與單寧酸遇酸、堿水解成其他成分有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示三果湯中β-PGG 含量較低，且酸堿條件對(duì)其影響不大。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超聲提取，研究分析不同pH 條件下測(cè)定三果湯中沒食子酸、單寧酸、β -PGG 的含量變化，建立了相關(guān)測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)提示當(dāng)pH 等于3 時(shí)，三果湯中沒食子酸、單寧酸含量最高;pH 等于5 時(shí)，三果湯中β-PGG 含量最高。提示沒食子酸、單寧酸、β-PGG，特別是沒食子酸可作為藏藥三果湯制劑相關(guān)質(zhì)控指標(biāo)之一，為藏藥三果湯中化學(xué)成分研究、藥效學(xué)研究及質(zhì)量控制等提供一定參考。

［1］楊繼家，張藝，冀靜，等.藏醫(yī)藥與印度傳統(tǒng)醫(yī)藥對(duì)三果湯傳統(tǒng)應(yīng)用及現(xiàn)代研究概述.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化［J］.2014，14(1)：1311 -1316.

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