一株豬丹毒桿菌的分離鑒定及其致病性實(shí)驗(yàn)

趙 墩，魏 榕，劉曉波，胡玉立，吳海超，屈泰龍，李潤(rùn)成，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

豬丹毒桿菌是一類纖小、不產(chǎn)酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。它能引起豬的急性或亞急性敗血癥和慢性的關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎。根據(jù)形態(tài)特征、生化試驗(yàn)等將豬丹毒桿菌原歸為乳桿菌科，丹毒桿菌屬。但目前以系統(tǒng)發(fā)生樹為分類基礎(chǔ)，該菌與支原體的同源性較近，同屬于柔膜菌綱，并獨(dú)立出丹毒桿菌科（參見《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》）。豬丹毒桿菌屬于該科的四個(gè)屬中的第I屬即丹毒桿菌屬。在地域上該病原呈世界性分布，是養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾病[1]；20年多前豬丹毒、豬肺疫、豬瘟被列為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)三大疾病。但隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；陌l(fā)展及抗生素的廣泛使用，豬丹毒在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)似乎對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害不大了。然而丹毒桿菌對(duì)環(huán)境有非常強(qiáng)的耐受能力，加之其宿主的多樣性使得該病很難被徹底消除。據(jù)報(bào)道，丹毒桿菌能廣泛存在于牛、羊、雞、火雞、鴿子、鸚鵡，甚至是海洋生物[2]。將感染豬丹毒致死的病死豬深埋于地下1.5米，140天后仍能分離到該病原。

近5年來(lái)國(guó)內(nèi)大型豬場(chǎng)陸續(xù)再次發(fā)生豬丹毒疫情，而且有的還表現(xiàn)為極高的死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，近年來(lái)該病在日本和美國(guó)的中部地區(qū)規(guī)模爆發(fā)[3]，并從2009年開始抬頭趨勢(shì)明顯[4]。從我國(guó)最近幾年的相關(guān)科研文章數(shù)量也可以看出，豬丹毒的危害在逐年增大。這可能提示豬丹毒桿菌的毒力可能發(fā)生了變化，而我國(guó)近30年來(lái)有關(guān)豬丹毒的毒力和致病性研究很少。本文通過(guò)對(duì)臨床發(fā)病的豬只進(jìn)行細(xì)菌分離，形態(tài)、PCR、生化鑒定等結(jié)果，確定所分離到的為豬丹毒桿菌，并對(duì)該病原進(jìn)行了小鼠和豬的致病性試驗(yàn)，得出所分離到的菌株為高致病性的豬丹毒桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料。湖南邵陽(yáng)某豬場(chǎng)，存欄育肥豬400多頭。2014年6月，部分豬只出現(xiàn)厭食、喜臥、不愿走動(dòng)、體溫升高等癥狀。第2天部分死亡，且皮膚出現(xiàn)紅斑或彌散性紅紫色，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)充滿大量泡沫、紅斑腎、胃腸道和膀胱黏膜有彌散性出血、脾腫大等典型癥狀。疑似患有急性豬丹毒病死豬為原始病料。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑。哥倫比亞血瓊脂，購(gòu)自于江門市凱林貿(mào)易有限公司；TSB培養(yǎng)基，購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生技術(shù)公司；犢牛血清，購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；生化鑒定管，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（新型微生物生化鑒定管）；引物為本實(shí)驗(yàn)室所設(shè)計(jì)[5]，TaqDNA聚合酶購(gòu)自天根生物工程公司；dNTP（2.5mmol/L）、DL2000DNAMarker均購(gòu)自大連寶生物工程公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)ICR雌性24～26g小白鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司、8～10周齡的陰性豬由湖南中岸生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化。取病死豬的心、肝、脾、肺、腎、靜脈血，并劃線接種于哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基，倒扣于37℃恒溫箱中培養(yǎng)36h。從平皿上挑取邊緣整齊、針尖大小的可疑單菌落接種于含有10%犢牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。

1.2.2 形態(tài)鑒定。將上述純培養(yǎng)菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢觀察。

1.2.3 PCR鑒定。以純培養(yǎng)液體作為模板0.5μL，10×Buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L）1μL，上、下游引 物（Ery16S-Fp：TGACATACCGCGCAAAAGCA，Ery16S-Rp：GGCTCCCTCCTAGTAAACTA，為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)[5）]各0.2μL(引物量10μmol/L），Taq酶（2.5U/μL）0.5μL，去離子水20μL。95℃預(yù)變性5min；94℃變 性30s，退 火 溫 度57℃、30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。并將PCR產(chǎn)物送至上海鉑尚生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 生化鑒定。將純化后的細(xì)菌按照常規(guī)方法接種于生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24h，按照說(shuō)明書判定結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

1.2.5.1 小鼠攻毒試驗(yàn)。隨機(jī)將36只ICR小鼠分為6組,并標(biāo)記為1、2、3、4、5和空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外每只小鼠皮下注射0.1mL經(jīng)生理鹽水稀釋后的菌液，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為：8.0×103、8.0×102、8.0×101、8.0×100、8.0×10-1CFU。空白對(duì)照組注射0.1mL生理鹽水。連續(xù)觀察小鼠7d，并記錄死亡情況和臨床表現(xiàn)，計(jì)算LD50。

1.2.5.2 豬攻毒試驗(yàn)。隨機(jī)將16頭8～10周齡的豬丹毒陰性豬分為4組,并標(biāo)記為A、B、C和空白對(duì)照組。每頭豬肌肉注射1mL經(jīng)生理鹽水稀釋后的菌液，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為：1.0×109CFU、1.0×108、1.0×107。空白對(duì)照組注射1mL生理鹽水。連續(xù)觀察7d，記錄好體溫變化及臨床癥狀。將死亡豬只進(jìn)行剖檢，觀察病理變化后挖坑深埋。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)?？梢婇L(zhǎng)有透明、露珠樣、針尖大小菌落。經(jīng)涂片、革蘭染色鏡檢，可觀察到呈纖細(xì)桿狀或長(zhǎng)絲狀的G+細(xì)長(zhǎng)的小桿菌。

2.2 PCR鑒定。經(jīng)瓊脂糖電泳后可觀察與目的大小一致的條帶（圖1）。目的片段經(jīng)測(cè)序分析后于NCBI進(jìn)行Blast分析，與丹毒桿菌同源性≥99%。將該菌命名為SY株。

圖1 分離單菌落PCR 鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 生化反應(yīng)鑒定結(jié)果。將純培養(yǎng)細(xì)菌接種到微生物生化鑒定管，所獲得的結(jié)果詳見表1。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)。將已培養(yǎng)細(xì)菌按梯度稀釋后皮下接種小鼠，觀察至第5d，1、2、3、小組的小鼠全部死亡(見表2)。取死亡的小鼠血液、肝臟進(jìn)行病原菌分離鑒定，可發(fā)現(xiàn)在血瓊脂平板上所生長(zhǎng)的細(xì)菌純粹且與接種注射的細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)一致。經(jīng)Kaber法計(jì)算可得，該菌對(duì)小鼠的LD50為1.75CFU。

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.5 豬攻毒試驗(yàn)。攻毒后12h內(nèi)A、B、C組和空白對(duì)照組均未出現(xiàn)明顯的變化，精神狀況良好。12～24h內(nèi)攻毒組注射部位均出現(xiàn)紅斑，并出現(xiàn)厭食現(xiàn)象，體溫升高。48h攻毒組注射部位紅斑明顯，極度厭食，四肢無(wú)力，眼瞼發(fā)干，體溫明顯升高。54h后，攻毒組注射部位中心紅斑暗黑，不進(jìn)食，四肢無(wú)力，體溫明顯升高；78h出現(xiàn)死亡，96h內(nèi)攻毒組全部死亡。解剖后各組均出現(xiàn)典型的豬丹毒癥狀（圖2）：皮膚出現(xiàn)紅斑或彌散性紅紫色、氣管內(nèi)充滿大量泡沫、胃腸道和膀胱黏膜有彌散性出血、紅斑腎且被膜容易剝離、脾臟腫大個(gè)別有出血、心耳出血。陰性無(wú)明顯臨床癥狀。不同劑量攻毒組的臨床表現(xiàn)無(wú)明顯差異。

圖2 攻毒死亡豬剖檢部分典型的豬丹毒癥狀

3 討論

根據(jù)鏡檢形態(tài)特征、臨床表現(xiàn)、鑒定分析和致病力試驗(yàn)確定所分離得菌株為豬丹毒桿菌強(qiáng)毒株。

本研究通過(guò)對(duì)所分離的菌株進(jìn)行PCR和生化鑒定后，將確診的豬丹毒桿菌進(jìn)行小鼠和豬的致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）所分離的SY毒株對(duì)小鼠和豬的致病性都很強(qiáng)；（2）將SY毒株接種豬丹毒抗體檢測(cè)陰性豬能復(fù)制出典型且明顯的豬丹毒癥狀；（3）很多研究者在復(fù)制豬丹毒感染豬的試驗(yàn)時(shí)由于毒株的致病性不同，所用活菌數(shù)集中在108～109CFU左右[1,4]，但SY毒株對(duì)豬的致病力107CFU便可致死8～10周齡抗體陰性仔豬，這可能是以前的研究者為了保證動(dòng)物模型的成功，使用了較高的攻毒劑量；也有可能是我們所分離到的SY株毒力更強(qiáng)。

（4）不同劑量攻毒組之間臨床表現(xiàn)無(wú)明顯差異，且107CFU攻毒劑量組首先出現(xiàn)死亡（我們分析為個(gè)體差異所致），這也提示我們所分離到的SY毒株對(duì)8～10周齡的陰性豬的致死攻毒劑量小于107CFU。

上世紀(jì)80年代豬丹毒、豬肺疫、豬瘟被列為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病。經(jīng)過(guò)多年的加強(qiáng)免疫，該病在規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生的頻率也逐年降低。有學(xué)者認(rèn)為我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)生長(zhǎng)豬基本不存在豬丹毒感染,但是最近幾年不僅僅是我國(guó)，乃至整個(gè)亞洲地區(qū)豬丹毒的爆發(fā)成常態(tài)性[6～9]。這提示我們豬丹毒疫情仍然存在，早在1994年就有學(xué)者提出豬丹毒預(yù)防注射不應(yīng)盲目停止[10]。目前疫苗接種仍然是預(yù)防該病的首要措施，不應(yīng)忽視。SY株強(qiáng)毒株的分離也提醒了我們要重視豬丹毒的預(yù)防。

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