副豬嗜血桿菌生化實(shí)驗(yàn)、衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象及藥敏實(shí)驗(yàn)

方 勤，傅勝才

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131）

副豬嗜血桿菌作為一種機(jī)會(huì)主義菌種在免疫抑制性疾病感染的情況下危害較大，它是一種能引起漿液性纖維素性炎癥的兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，主要影響一些缺乏免疫力的保育豬，發(fā)病率通常在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%左右[2]。為了加快對(duì)副豬嗜血桿菌的分離鑒定，一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法是必不可少的。以此為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)副豬嗜血桿菌做了一些初步研究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生化實(shí)驗(yàn)材料：葡萄糖、蔗糖、果糖、β-半乳糖苷、麥芽糖、蛋白胨水、尿素、新型微生物微量生化鑒定管、過氧化氫酶試劑、氧化酶試紙、靛基質(zhì)試劑。

1.1.2 衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象材料：鮮血瓊脂平板。

1.1.3 藥敏實(shí)驗(yàn)材料：抗菌藥物藥敏紙片。

1.1.4 TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基[3]：

（1）1000mLTSA配制：胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基42g，加入890mL蒸餾水，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7.3左右，121℃高溫蒸汽滅菌15min，恒溫烘箱冷卻至60℃，加入100mL新生牛血清（購(gòu)自浙江某生物公司，后同）和10mL2g/L過濾除菌NAD，倒平板，4℃保存。

（2）1000mLTSB配制：胰蛋白胨大豆肉湯30g，加入890mL蒸餾水，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7.3左右，121℃高溫蒸汽滅菌15min，恒溫烘箱冷卻至60℃，加入100mL新生牛血清和10mL2g/L過濾除菌NAD，4℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生化實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 氧化酶試驗(yàn)：將HPS的TSB液體培養(yǎng)基滴于氧化酶試紙上，觀察顏色變化。

1.2.1.2 過氧化氫酶試驗(yàn)：將HPS的TSB液體培養(yǎng)基50μL用無菌注射器注入過氧化氫酶生化鑒定管中，30s后輕輕振蕩，觀察結(jié)果。

1.2.1.3 葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖生化鑒定：用少量冰醋酸注入各新型微生物微量生化鑒定管確定其變色是由紫色變無色再變黃色，然后在進(jìn)行試驗(yàn)，挑取TSA培養(yǎng)基上的HPS單個(gè)菌落于TSB液體培養(yǎng)基中稀釋至50μL，然后將這50μL稀釋液用無菌注射器注入葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖新型微生物微量生化鑒定管（4種均注入50μL），37℃培養(yǎng)24～48h后觀察顏色變化。

1.2.1.4 蛋白胨水生化鑒定：挑取TSA培養(yǎng)基上的HPS單個(gè)菌落于TSB液體培養(yǎng)基中稀釋至50μL，然后將這50μL稀釋液用無菌注射器注入蛋白胨水新型微生物微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24～48h后加入靛基質(zhì)試劑2～3滴，觀察顏色變化

1.2.1.5 β-半乳糖苷生化鑒定：挑取TSA培養(yǎng)基上的HPS單個(gè)菌落于TSB液體培養(yǎng)基中稀釋至50μL，然后將這50μL稀釋液用無菌注射器注入β-半乳糖苷新型微生物微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24～48h后觀察顏色變化。

1.2.1.6 尿素生化鑒定：挑取TSA培養(yǎng)基上的HPS單個(gè)菌落于TSB液體培養(yǎng)基中稀釋至200μL，然后將這200μL稀釋液用無菌注射器注入尿素新型微生物微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24～48h后觀察顏色變化。

1.2.2 衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象：取5只滅菌EP管分別編號(hào)1，2，3，4，5。分 別 向 其 中 加 入200μL，100μL，100μL，100μL，100μLHPS的TSB液體培養(yǎng)基，用滅菌槍頭沾取少量金黃色葡萄球菌至1號(hào)管打勻，然后吸取100μL至2號(hào)管打勻，再?gòu)?號(hào)管吸取100μL至3號(hào)管打勻，以此類推到5號(hào)管，最后從每只EP管中吸取100μL菌液分別在鮮血瓊脂平板上涂板，37℃恒溫培養(yǎng)。取現(xiàn)象最明顯的一板作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

取HPS的TSB液體培養(yǎng)基100μL至于TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，分別涂板9塊并貼上強(qiáng)力霉素，林可霉素，復(fù)方新諾明，頭孢噻肟，新霉素，氨芐西林，青霉素，恩諾沙星，氟苯尼考9種抗菌藥物藥敏紙片。

2 結(jié)果

2.1 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過24～48h的37℃恒溫培養(yǎng)后可知副豬嗜血桿菌能分解葡萄糖、蔗糖、果糖產(chǎn)酸，與氧化酶、過氧化氫酶發(fā)生反應(yīng)為陽性，而其不分解麥芽糖、β-半乳糖苷、尿素、蛋白胨水為陰性。詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象結(jié)果

涂板了副豬嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌鮮血瓊脂平板在37℃恒溫培養(yǎng)12h后開始長(zhǎng)出金黃色葡萄球菌，然而并未長(zhǎng)出副豬嗜血桿菌，直到培養(yǎng)96h后才在金黃色葡萄球菌周圍長(zhǎng)出肉眼模糊可見的副豬嗜血桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)24h才能看見針尖大小副豬嗜血桿菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

副豬嗜血桿菌在TSA上涂板并貼上抗菌藥物藥敏紙片37℃恒溫培養(yǎng)48h后，可知大多數(shù)抗菌藥物都對(duì)其有作用，其中頭孢噻肟最好，復(fù)方新諾明最差，結(jié)果見表2。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 分析與討論

目前，副豬嗜血桿菌已成為豬場(chǎng)常發(fā)病，且大多數(shù)為混合感染，比較簡(jiǎn)易的鑒別方法主要是染色鏡檢、衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象和藥敏實(shí)驗(yàn)。生化鑒定僅具有參考價(jià)值，主要由于其數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，這個(gè)原因可能來自于試劑生產(chǎn)者或配制者的不同。染色鏡檢是最常規(guī)且最便捷的，主要是由于副豬嗜血桿菌的染色形態(tài)及效果和其他細(xì)菌是有明顯區(qū)別的，副豬嗜血桿菌作為一種革蘭氏陰性桿菌較其他細(xì)菌染色之后顏色較淺，且會(huì)出現(xiàn)不同的形態(tài)特征，如1日齡副豬嗜血桿菌多數(shù)成短桿狀，2日齡就會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)絲狀菌且染色效果變差，3日齡基本為長(zhǎng)絲狀且染色效果較2日齡更差。衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象也是鑒別副豬嗜血桿菌的常用手段，以副豬嗜血桿菌涂板，金黃色葡萄球菌劃線的方法最好，但金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速度是遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于副豬嗜血桿菌，這是由于鮮血瓊脂平板中NAD濃度不夠需要在金黃色葡萄球菌溶血后補(bǔ)充其濃度。藥敏實(shí)驗(yàn)也可以作為其一種鑒定方法，主要由于副豬嗜血桿菌對(duì)頭抱類藥物敏感，對(duì)復(fù)方磺胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及氯霉素敏感性不敏感，而且大多數(shù)常見抗菌藥物對(duì)其都有效果，做藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)藥敏片多于2個(gè)就會(huì)出現(xiàn)副豬嗜血桿菌不生長(zhǎng)或只在遠(yuǎn)離藥敏紙片的地方出現(xiàn)副豬嗜血桿菌。雖然副豬嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物敏感但治療效果并不是非常理想，其主要的防治方法還是提高豬體免疫力，包括副豬嗜血桿菌的免疫接種[4]和防止豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和圓環(huán)2型病毒(PCV-2)等免疫抑制性疾病。

[1]高鵬程，儲(chǔ)岳峰，逯忠新，等.副豬嗜血桿菌病原的分離鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(12):27-29.

[2]蔡旭旺. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[3]陳勇,高艷,楊增歧.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與培養(yǎng)基篩選.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展[J].2013,34 (10) : 67-71.

[4]宋鳳香,陸桂英,肖麗輝,等.副豬嗜血桿菌滅活疫苗對(duì)仔豬免疫保護(hù)效力的研究[J].山東畜牧獸醫(yī),2010,31(6):8-9.