西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織中NO/iNOS水平的影響

王棟棟，魏彤，何素梅，張冠英，尹弟，魏群利, 2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

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西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織中NO/iNOS水平的影響

王棟棟1，魏彤1，何素梅1，張冠英1，尹弟1，魏群利1, 2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院 臨床藥理教研室，江蘇 徐州 221004)

目的 探討西格列汀(sitagliptin，SIT)對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織中一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)的影響。方法 高脂飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立大鼠糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)模型，成模后隨機(jī)分為模型組(DN組)和西格列汀組(SIT組)，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(NC組)。連續(xù)灌胃12周后，每組各剩6只大鼠，Griess比色法檢測(cè)各組腎組織中NO含量；RT-PCR法檢測(cè)腎組織iNOS mRNA的表達(dá)；免疫組化及Western blot法檢測(cè)腎組織iNOS蛋白的含量。結(jié)果 與NC組相比，DN組的iNOS表達(dá)增強(qiáng)，NO水平升高；與DN組相比，SIT組的iNOS表達(dá)降低，NO水平下降。結(jié)論 SIT可降低糖尿病腎病早期腎組織iNOS表達(dá)及NO含量，這可能是其延緩或阻止2型糖尿病腎病進(jìn)展的機(jī)制之一。

西格列??；2型糖尿病腎??；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；一氧化氮

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是常見的內(nèi)分泌-代謝疾病，流行病學(xué)研究顯示，我國成人糖尿病患病率已上升至11.6%[1]，其中糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)為DM最常見的并發(fā)癥[2-5]。近年來研究表明，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)的增強(qiáng)、一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放的增加是早期DN發(fā)病機(jī)制之一[6-8]。

西格列汀(sitagliptin，SIT)是一種新的治療2型糖尿病藥物，能顯著改善早期糖尿病腎病的腎臟損害[9]，但作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過高脂飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，探索SIT對(duì)DN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只， SPF級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(蘇)2010-0011。

1.2 藥品與儀器 西格列汀(默沙東，批號(hào)：Y0993)；鏈脲佐菌素(Sigma公司，批號(hào)：wxbb2432v)；一氧化氮試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；iNOS及β-actin引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；兔抗iNOS多克隆抗體(美國Abcam公司，批號(hào)：GR126616-1)；兔抗GAPDH多克隆抗體(美國Abcam公司，批號(hào)：GR100112-3)；熒光二抗(Odyssey Sa公司，批號(hào)：C40721-02)；超敏兔兩步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋，批號(hào)：K155208A)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋，批號(hào)：K1553317E)；One Touch 血糖儀(美國強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)；BX43F型正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)(美國Carestream公司)；紅外成像系統(tǒng)(美國Odyssey Sa公司)。

1.3 造模與給藥 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和高脂組(n=20)。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂組給予高脂飲食(36.3%脂肪、45%碳水化合物、18.7%蛋白質(zhì))。飲食干預(yù)4周后，禁食12 h，高脂組大鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin，ST，30 mg/kg)[10-12]，濃度為1%，給藥體積為0.9～1.2mL，對(duì)照組大鼠注射等體積的枸櫞酸緩沖液。一周后，空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)<7.8 mmol/L的大鼠再次腹腔注射30 mg/kg STZ。每周檢測(cè)一次大鼠FBG，4周后，將兩次FBG≥7.8 mmol/L或一次FBG ≥11.1 mmol/L的判為2型糖尿病大鼠[13]，共成模17只。將造模成功大鼠分為糖尿病腎病組(DN組，n=9)及西格列汀干預(yù)組(SIT組，n= 8)，西格列汀組每天給予10 mg/kg[14]的SIT灌胃，濃度為4mg/mL,給藥體積為0.875～1.125mL,糖尿病腎病組及對(duì)照組(NC組，n= 9)均給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃12周后各組均剩6只，處死后取腎組織備測(cè)。

1.4 方法

1.4.1 Griess法檢測(cè)腎組織中NO水平：具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 RT-PCR法檢測(cè)腎組織iNOS mRNA的表達(dá)：按Trizol試劑說明書方法提取腎組織總RNA，取1 μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所用 RT-PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下：iNOS正向引物序列為：5’-GGCAAGATGCACATTACC -3’，反向引物序列為：5’-TTGACATCCCTTCCTGGA-3’，產(chǎn)物長度為249 bp；β-actin正向引物序列為：5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’， 反向引物序列為：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’， 產(chǎn)物長度為432 bp。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)對(duì)每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描，用iNOS的灰度值與β-actin的比值表示目的基因iNOS的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 免疫組化法檢測(cè)腎組織iNOS蛋白的表達(dá):腎組織石蠟包塊連續(xù)切片(厚4 μm)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)iNOS蛋白的表達(dá)，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行?？贵w按1:200的比例稀釋，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，iNOS蛋白陽性區(qū)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.4.4 Western blot法檢測(cè)腎組織iNOS蛋白的含量:取100 mg腎組織加入1 mL裂解液充分勻漿混勻，冰上放置10 min，4 ℃，12000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至EP管，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制5%的濃縮膠及10% 的分離膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h，一抗(1:200)4 ℃ 過夜，洗膜，熒光二抗37 ℃ 孵育2 h，洗膜，紅外成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析條帶灰度值，以iNOS的灰度值與β-actin的比值表示iNOS的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 腎組織NO的水平 NC組NO的水平為(55.29±1.47) μmol/L；DN組NO的水平為(68.71±5.19) μmol/L；SIT組NO的水平為(58.53±1.67) μmol/L。與NC組相比，DN組大鼠腎組NO的水平升高(P<0.05)；與DN組相比，SIT組大鼠NO的水平有所降低(P<0.05)，說明SIT有降低NO水平的作用，見圖1。

圖1 SIT對(duì)糖尿病大鼠腎組織NO水平的影響(n=6)*P<0.05，與 NC 組比較； #P<0.05，與DN 組比較Fig.1 Effects of SIT on the level of NO in renal tissues of diabetic rats(n=6)*P<0.05， compared with NC group；#P<0.05，compared with DN group

2.2 腎組織iNOS mRNA的表達(dá) 各組iNOS mRNA的相對(duì)灰度值分別為NC組：0.06±0.01，DN組：0.15±0.02，SIT組：0.13±0.01。與NC組相比，DN組大鼠腎組織iNOS mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與DN組相比，SIT組大鼠iNOS mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，說明SIT有抑制iNOS mRNA表達(dá)的作用，見圖2。

圖2 SIT對(duì)糖尿病大鼠腎組織iNOS mRNA表達(dá)的影響(n=6)**P<0.01，與 NC 組比較； #P<0.05，與DN 組比較Fig.2 Effects of SIT on the expression of iNOS mRNA in renal tissues of diabetic rats(n=6)**P<0.01，compared with NC group；#P<0.05，compared with DN group

2.3 腎組織iNOS蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果所示，NC組大鼠腎組織iNOS低表達(dá)，陽性顆粒散在，染色較淺；DN組iNOS高表達(dá)，棕黃色信號(hào)強(qiáng)，融合成片；而SIT組iNOS表達(dá)又有降低，見圖3；Western blot結(jié)果顯示，各組iNOS蛋白相對(duì)灰度值，NC組：0.04±0.01，DN組：0.15±0.03，SIT組：0.09±0.04。與NC組相比，DN組大鼠腎組織iNOS蛋白含量升高(P<0.01)；與DN組相比，SIT組大鼠腎組織iNOS蛋白含量降低(P<0.05)；說明SIT能抑制糖尿病大鼠腎組織iNOS蛋白的表達(dá)。

圖3 免疫組化法檢測(cè)SIT對(duì)糖尿病大鼠腎組織iNOS蛋白表達(dá)的影響(×200)Fig.3 Effect of SIT on the expression of iNOS in renal tissues of diabetic rats by immunohistochemical method(×200)

圖4 Western blot法檢測(cè)SIT對(duì)糖尿病大鼠腎組織iNOS蛋白表達(dá)的影響(n=6)**P<0.01，與 NC 組比較； #P<0.05，與DN 組比較Fig.4 Effect of SIT on the expression of iNOS in renal tissues of diabetic rats by western blot(n=6)**P<0.01， compared with NC group；#P<0.05，compared with ND group

3 討論

糖尿病早期的腎小球高灌注、高濾過等血流動(dòng)力學(xué)異常是導(dǎo)致DN的重要原因。其中，NO水平的升高是糖尿病血流動(dòng)力學(xué)異常的一個(gè)重要因素[15]，主要是因?yàn)镹O對(duì)腎臟入球小動(dòng)脈的擴(kuò)張作用遠(yuǎn)大于出球小動(dòng)脈，直接參與了DN早期腎小球高灌注、高濾過的形成[16]。

NO是一個(gè)具有廣泛生理活性的小分子，具有強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，可由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原生成。NOS主要有兩類，一類是構(gòu)成型一氧化氮合酶(constitutive NOS，cNOS)，包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases，eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)，是許多正常組織中基本存在的一種酶；另一類是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)，只在細(xì)胞受到刺激如微生物內(nèi)外毒素、炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子、白介素)等的傷害后才顯著表達(dá)[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18-20]，在糖尿病早期，腎臟iNOS的表達(dá)明顯增強(qiáng)，NO生成增加。

在本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病大鼠腎病早期腎組織iNOS的表達(dá)增強(qiáng)、NO生成增加，與前期本課題組陳肖[6]在細(xì)胞水平的發(fā)現(xiàn)一致。由于NO水平的升高直接參與了DN早期腎小球高灌注、高濾過的形成，是早期糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素之一，所以減少NO的水平對(duì)防治早期糖尿病腎病的進(jìn)展意義重大；給予西格列汀干預(yù)的大鼠，腎組織中iNOS表達(dá)顯著下調(diào)、NO的水平下降。然而，西格列汀是通過何種信號(hào)通路來下調(diào)iNOS表達(dá)的，目前還尚不清楚，本課題組將在接下來的研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，SIT可降低腎組織iNOS表達(dá)及NO含量從而減輕腎臟損傷，這可能是其延緩或阻止2型糖尿病腎病進(jìn)展的機(jī)制之一。

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(編校：譚玲)

Effect of sitagliptin on the expression of NO/iNOS in type 2 diabetic nephropathy

WANG Dong-dong1, WEI Tong1, HE Su-mei1, ZHANG Guan-ying1, YIN Di1, WEI Qun-li1, 2

(1. Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China; 2.Department of Clinical Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

ObjectiveTo investigate effect of sitagliptin (SIT) on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in type 2 diabetic nephropathy.Methods30 rats were randomly divided into normal group (NC group), diabetic nephropathy group (DN group) and sitagliptin treatment group (SIT group).The type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats were induced by a high fat diet (HFD) plus repeated low dose streptozocin (STZ) injections.At the end of the 12thweek in treatment,there were 6 rats in each group, the NO level was determined by Griess method.mRNA levels of iNOS RT-PCR was detect ed by.The expression of iNOS protein was detected by western blot and immunohistochemical method.ResultsCompared with the NC group, the expression of iNOS and NO of DN group increased significantly. However, compared with DN group, the expression of iNOS and NO of SIT group decreased significantly.ConclusionSIT can decrease the expression of iNOS and NO, which implies SIT may protect the type 2 diabetic kidney.

sitagliptin; type 2 diabetic kidney; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide

國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201410313024)；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410313024Z)；徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2014YKYCX013)

王棟棟，男，碩士，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，E-mail：m13852029591@163.com；魏群利，通訊作者，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，E-mail：weiqunli@126.com。

R962

A

1005-1678(2015)07-00010-04