瘤內siRNA干擾血管內皮生長因子對惡性黑色素瘤的放射增敏作用

龐得全，王英曼，戴云飛，白靜，鄭維國，宮鳳玲，趙志宇

(1.華北理工大學附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學 藥理系，河北 唐山 063000；4.華北理工大學附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000；5.華北理工大學附屬醫(yī)院影像科，河北 唐山 063000；6.華北理工大學附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

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瘤內siRNA干擾血管內皮生長因子對惡性黑色素瘤的放射增敏作用

龐得全1，王英曼2，戴云飛1，白靜3，鄭維國4，宮鳳玲5，趙志宇6

(1.華北理工大學附屬醫(yī)院 放療科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學 藥理系，河北 唐山 063000；4.華北理工大學附屬醫(yī)院 急診科，河北 唐山 063000；5.華北理工大學附屬醫(yī)院影像科，河北 唐山 063000；6.華北理工大學附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的 研究瘤內siRNA干擾VEGF的表達對惡性黑色素瘤放射敏感性的影響。方法 首先建立惡性黑色素瘤A375細胞的裸鼠移植瘤模型，采用脂質體包裹的小RNA干擾技術，將惡性黑色素瘤移植瘤裸鼠隨機分為空白對照組、VEGF陰性質粒組、VEGF陽性質粒組，每周2次測腫瘤體積，計算腫瘤體積抑瘤率；HE染色進行組織形態(tài)學觀察，計算腫瘤橫斷面壞死面積率；免疫組化法測定瘤體血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。結果 VEGF陽性質粒組VEGF的表達減弱(P<0.05)，VEGF陽性質粒組有較多的組織壞死，腫瘤生長明顯抑制(P<0.05)。結論 瘤內注射脂質體包裹的siRNA-VEGF對惡性黑色素瘤有放射增敏作用，為臨床開展針對VEGF基因的靶向治療和放射治療的聯合治療惡性黑色素瘤提供了實驗依據。

血管內皮生長因子；siRNA；放療敏感性；惡性黑色素瘤；凋亡

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是目前發(fā)生率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一，惡性度高，預后較差[1]。我國MM較少見，但發(fā)病率逐年升高，手術治療是其主要治療手段，但我國MM患者因就診時病期較晚而失去手術機會。放射治療是治療惡性腫瘤的重要輔助手段之一，然而惡性黑色素瘤對放射治療不敏感[2]，限制了放射治療的應用。如何增加惡性黑色素瘤的放射敏感性一直是放療研究的熱點和重點[3]。通過基因治療方式改變腫瘤細胞的內在放射敏感性是一種新的增敏方式，它除具有增敏效果外，還具有直接或間接誘導細胞凋亡和刺激免疫反應的作用。

惡性黑色素瘤是一種高血管侵襲性的腫瘤，抑制其血管生成是重要的治療手段[4]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知活性最強的促血管生成因子，與腫瘤的生長、轉移和預后密切相關[5-6]。VEGF是輻射后血管增殖重要的調節(jié)因子，它和抗凋亡蛋白Bcl-2具有協(xié)同作用，增加機體和腫瘤組織對輻射的抗性。研究表明，惡性黑色素瘤中VEGF表達較色素痣明顯增高[7]，缺氧是VEGF最重要的誘導因素，放療在殺傷腫瘤細胞的同時可加重腫瘤微環(huán)境的乏氧狀態(tài)，誘導VEGF 表達上調，促進乏氧細胞對射線抗拒。因此，VEGF是重要的放療敏感性的靶點。本實驗以VEGF為靶點，應用siRNA干擾技術，在體內觀察其對A375細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 惡性黑色素瘤細胞A375購自ATCC，用添加了10%胎牛血清(購自Gibco)和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合到80%時傳代。

1.1.2 實驗動物 SPF級BALB/c雌性裸鼠25只，其中一只用來培養(yǎng)移植瘤，4周齡，體質量14～16 g，由華北理工大學實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK(冀)2010-0038]，動物實驗在華北理工大學SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)1周后用于試驗。

1.1.3 實驗材料 細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基(RPMI 1640)、L-谷氨酰胺以及胎牛血清均購自Gibco公司；VEGF siRNA由上海吉瑪生物公司合成；VEGF一抗，二抗購于美國Abcam公司；ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；其他常規(guī)試劑均購自上海國藥集團。

1.1.4 儀器：DHP-9272細胞培養(yǎng)箱(上海呈天實驗儀器公司)；DYY-11型凝膠電泳儀(北京六一實驗儀器公司)；Mias系列圖像處理系統(tǒng)購；Eclipse Ci-E正置顯微鏡(尼康)。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-siRNA重組質粒的構建和鑒定：VEGF-siRNA質粒購自上海吉瑪生物公司：根據GenBank(access number U75285)人VEGF基因mRNA的已知序列，尋找符合特征的靶序列，使用Genscript公司在線設計軟件(http：//www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai)，合成針對編碼區(qū)(399-417)堿基序列的1條DNA寡核苷酸鏈，同時設計1條negative序列用于對照組實驗，該序列與siRNA序列有相同的組成，但是和VEGF mRNA沒有明顯的同源性。通過BLAST軟件進行序列同源性分析，與人類其他基因無同源性，設計序列如下：

VEGF-siRNA：5’-GAAAGATAGAGCAAGACAAttcaagaga TTG-TCTTGCTCTATCTTTC-3’；對照-siRNA：5’-GTATAAG-TCAACTG-TTGACttcaagagaGTCAACAGTTGACTTATAC-3’。

化學合成各單鏈DNA片段退火形成雙鏈DNA，定向克隆至BamHⅠ和HindⅢ雙切空質粒pRNAT-U6.1中，獲得siRNA的表達載體。

1.2.2 惡性黑色素瘤裸鼠皮下種植瘤模型的建立和干預：取對數生長期貼壁生長的A375細胞，胰酶消化，PBS液吹打懸浮細胞，離心5 min，棄上清，PBS液重懸細胞，調整細胞數5.0×104個/ μL。A375細胞懸液搖勻后注射250 μL于裸鼠右腋部皮下，待接種的瘤細胞成瘤并直徑達到1.0 cm時，處死動物，剝離腫瘤塊，用銳利刀片縱向均勻切成24份，分別轉種于24只5周齡裸鼠右腋部皮下，以皮下結節(jié)長徑超過0.5 cm為成瘤標準。轉種后1周達到成瘤標準，然后進行治療。

實驗分為3組，每組8只：①空白對照組：瘤內注射0.1 mL PBS；②VEGF陰性質粒組：無關干擾聯合放療組，在瘤體內注射脂質體包裹的對照siRNA質粒20 μg；③VEGF陽性質粒組： siRNA-VEGF聯合放療組，瘤內注射脂質體包裹的siRNA-VEGF質粒20 μg。第1周予BJ-6型直線加速器照射瘤體局部4Gy，瘤體表面覆蓋1cm厚凡士林紗布。每周質粒注射2次，共4次。

1.2.3 Western blot和免疫組織化學檢測VEGF的表達：Western blot：收集腫瘤組織塊，加入1 mL蛋白裂解液，研磨后12000 r/min離心，取上清，按照CBA蛋白定量試劑盒使用說明檢測蛋白濃度。每管加入緩沖液，95 ℃煮沸5 min，蛋白樣品用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白電轉到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加相應的鼠抗兔VEGF一抗(稀釋1000倍)4 ℃過夜，加入相應的偶聯兔抗人VEGF二抗(稀釋1000倍)2 h，用ECL發(fā)光法檢測，成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的條帶與Actin條帶的比值代表目的蛋白的相對表達水平。免疫組織化學：獲取腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋，制片。

1.2.4 腫瘤壞死面積測量：每周測量惡性腫瘤的長(a)寬(b)高(c)，以公式計算腫瘤體積=(a×b×c)π/6 mm3。腫瘤壞死面積：面積計算采用Image-Pro-Plus軟件，首先選中腫瘤部位，軟件自動獲得面積所占像素數，根據比例尺獲得的像素-長度比例(mm2/像素)將面積換算為絕對面積(mm2)。

2 結果

2.1 瘤內注射重組質粒對惡性黑色素瘤VEGF表達的影響 空白對照組移植瘤注射PBS和VEGF陰性質粒組2周后VEGF的表達沒有顯著影響，而VEGF陽性質粒組可以顯著抑制移植瘤VEGF的表達(見圖1A)。Western blot半定量分析表明(見圖1B)，VEGF陽性質粒組明顯抑制了VEGF蛋白的表達，蛋白表達量只有空白對照組的(12.66±1.57)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明pRNAT-U6.1-siRNA重組質粒對VEGF 蛋白的表達起到了抑制作用。見圖1、圖2。

圖1 瘤內注射重組質粒對惡性黑色素瘤VEGF免疫組化(A)及Western blot(B)結果(n=8)Fig.1 Expression of immunohistochemical(A) and Western blot(B) of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)

圖2 瘤內注射重組質粒對惡性黑色素瘤VEGF表達百分率比較(n=8)**P<0.01，與空白對照組比較Fig.2 Comparison of expression percentage of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)**P<0.01，compared with control group

2.2 瘤內注射si-VEGF重組質粒對惡性黑色素瘤放療敏感性的影響 瘤內注射重組質粒，每周測量并計算惡性腫瘤的長(a)寬(b)高(c)，以公式腫瘤大小=(a×b×c)π/6 mm3。照射前移植瘤體積：空白對照組：(11.870±1.230)mm3；VEGF陰性質粒組：(11.770±1.030)mm3；VEGF陽性質粒組：(11.660±1.056)mm3，差異均無統(tǒng)計學意義。單純給予siRNA-VEGF質粒2周后即可顯著抑制腫瘤的生長，生長2周后移植瘤體積：空白對照組：(14.902±1.392)mm3；VEGF陰性質粒組：(16.528±1.461)mm3；VEGF陽性質粒組：(13.152±1.136)mm3；VEGF陽性質粒組低于空白對照組，(P<0.05)。VEGF陰性質粒組高于空白對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 瘤內注射si-VEGF對惡性黑色素瘤生長的作用(n=8)*P<0.05，與空白對照組比較Fig.3 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma (n=8)*P<0.05，compared with control group

注射質粒4次，并給予放射治療后腫瘤體積計算同上，在照射后第2周腫瘤體積siRNA-VEGF組與對照組比較顯著減少，第3次注射后移植瘤體積：空白對照組：(5.026±0.462)mm3；VEGF陰性質粒組：(6.549±0.469)mm3；VEGF陽性質粒組：(4.261±0.436)mm3； VEGF陽性質粒組低于VEGF陰性質粒組(P<0.01)；第4次注射后移植瘤體積：空白對照組：(4.102±0.248)mm3；VEGF陰性質粒組：(4.862±0.468)mm3；VEGF陽性質粒組：(2.654±0.363)mm3； VEGF陽性質粒組低于VEGF陰性質粒組(P<0.01)。見圖4。

圖4 瘤內注射si-VEGF重組質粒對放療后惡性黑色素瘤大小的影響(n=8)**P<0.01，與VEGF陰性質粒組比較Fig.4 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma after radiation(n=8)**P<0.01,compared with VEGF negtive plasmid group

VEGF陽性質粒組與對照組比較，腫瘤壞死面積顯著增加，空白對照組：(6.734±0.449)mm2；VEGF陰性質粒組：(5.243±0.584)mm2；VEGF陽性質粒組：(11.760±1.435)mm2；VEGF陽性質粒組大于空白對照組和VEGF陰性質粒組，(P<0.001)。見圖5。

圖5 瘤內注射si-VEGF重組質粒對惡性黑色素瘤壞死面積的影響(n=8)ΔΔΔP<0.001，與VEGF陽性質粒組比較Fig.5 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the area of melanoma necrosis after radiation (n=8)ΔΔΔP<0.001，compared with VEGF positive plasmid group

3 討論

惡性黑素瘤是由皮膚和其他器官黑素細胞產生的腫瘤，皮膚黑素瘤表現為色素性皮損在數月或數年中發(fā)生明顯改變。其發(fā)病率雖低，但其惡性度高，轉移發(fā)生早，死亡率高，因此早期診斷、早期治療很重要。對早期未轉移的病變應行根治性手術切除，應根據Breslow深度確定切除范圍，如果是指(趾)惡性黑素瘤，可采用截指(趾)術。應切除受累淋巴結，但預防性淋巴結切除仍有爭議。肢體動脈灌注抗有絲分裂藥物治療肢體黑素瘤有一定療效。對于發(fā)生廣泛轉移者可采用聯合化療和放射治療。生物化學治療和分子靶向治療具有很大的前景。

本實驗研究結果得出，免疫組化與Western blot 均發(fā)現了pRNAT-U6.1-siRNA重組質粒對VEGF 蛋白的表達起到了抑制作用，進而抑制腫瘤的生長。通過使用BJ-6型直線加速器照射瘤體局部4Gy后，本研究發(fā)現VEGF抑制組腫瘤體積顯著減少，提示了應用pRNAT-U6.1-siRNA重組質粒對腫瘤放療敏感性的提高。目前已經有研究針對VEGF和VEGF受體下游酪氨酸激酶的小分子靶向抑制藥物和阻斷性單克隆抗體，取得了一定的效果[8]。然而這些治療存在著半衰期短，潛在的全身性副作用等自身不足，限制了其臨床應用。siRNA干擾技術是最新的基因阻斷技術，由雙鏈RNA介導、在轉錄后mRNA 水平關閉相應基因的表達，是序列特異性的轉錄后基因沉默，在某種程度上可以達到基因敲除的效果[9]。siRNA 干擾技術相對于傳統(tǒng)的反義核酸、基因剔除等技術，具有嚴格序列特異性、治療針對性強、級聯放大效應等優(yōu)點，故成為基因功能探索與治療的全新研究手段，應用RNAi 技術抑制內外源性致病基因的表達正成為基因治療的研究熱點。目前國內外已有使用siRNA干擾技術基因沉默VEGF基因在卵巢癌、膀胱癌等腫瘤中的表達的相關研究報道[10-13]。結果表明，VEGF-siRNA抑制腫瘤細胞的增殖、誘導凋亡，但VEGF -siRNA是否能增加惡性黑色素瘤細胞放射敏感性的研究未見報道。

然而目前siRNA干擾技術仍然存在著一些問題，包括RNA干擾的序列選擇、衰減現象、轉染效率等等，因此單純的RNAi阻斷VEGF基因表達并不容易取得理想的腫瘤治療效果。本實驗研究僅限于裸鼠體內研究，而人體內微環(huán)境更加復雜，干擾因素更多，如何真正在人體內實現基因治療及其放療增敏機制還有待進一步研究。

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(編校：譚玲)

Effect of siRNA interfering vascular endothelial growth factor on radiation sensitization of malignant melanoma

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, DAI Yun-fei1, BAI Jing3, ZHENG Wei-guo4, >GONG Feng-ling5, ZHAO Zhi-yu6

(1．Department of Radiotherapy, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 3.Department of Pharmacology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 4.Department of Emergency, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 5.Department of Radiology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 6.Department of Stomatology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the role of a small RNA interference against VEGF in radiation sensitivity in melanoma.MethodsA375 human melanoma cell lines were transplanted into nude mice，which with malignant melanoma were randomly divided into control group, VEGF negative plasmid group and VEGF positive plasmid group, followed by 4Gy irradiation twice a week for 2 weeks. The volume of tumor was calculated twice a week， the area of tumor necrosis was assayed by HE，the expression of VEGF in tumor was determined by Western-blot and Immunohistochemical.ResultsThe expression of VEGF in VEGF positive plasmid group decreased significantly (P<0.05), VEGF positive group had more tissue necrosis, tumor growth was significantly inhibited (P<0.05).ConclusionsiRNA-VEGF in tumor injection liposome encapsulated in malignant melanoma has a role in the radiation sensitization, which provides an experimental basis for the clinical development of targeted therapy combined with radiotherapy for the treatment of VEGF gene.

vascular endothelial growth factor; siRNA; radiation sensitivity; malignant melanoma; apoptosis

唐山市科技局指令性計劃(12140209A-30)；河北省科技廳 (112761175)

龐得全，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射增敏及腫瘤分子生物學；腫瘤放射治療和綜合治療，E-mail: pdq1974@aliyun.com。

R739.5

A

1005-1678(2015)08-0048-04