ABL酪氨酸激酶及突變體蛋白ABLT315I的分離純化及活性鑒定

劉素曉，王幼平，崔琳，劉衛(wèi)紅，沈思，邢作英

(河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 中心實驗室，河南 鄭州 450000)

?

ABL酪氨酸激酶及突變體蛋白ABLT315I的分離純化及活性鑒定

劉素曉，王幼平Δ，崔琳，劉衛(wèi)紅，沈思，邢作英

(河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 中心實驗室，河南 鄭州 450000)

目的 建立一種簡單、穩(wěn)定、高效分離純化ABL酪氨酸激酶及其突變體ABLT315I的方法。方法abl及其定點突變基因插入pET-28a載體后，與pGEX6P-1-ptp-1b共同轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，加入異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導ABL酪氨酸激酶及其突變體的表達，親和層析和凝膠過濾層析純化蛋白，SDS-PAGE 分析蛋白純度與相對分子量，BCA法測定蛋白濃度，ATP/NADH偶聯(lián)法測定蛋白激酶活性。結果 SDS-PAGE顯示ABL及ABLT315I蛋白具有很高的純度，并且其濃度分別達到28 mg/L(LB菌液)和20 mg/L(LB菌液)。2種目的蛋白在體外均測得了很好的酪氨酸激酶活性。結論 本研究成功建立了一種穩(wěn)定、簡單高效的ABL蛋白及其突變體的分離純化方法，為后續(xù)蛋白進行高通量藥物篩選和結構分析建立良好的基礎。

慢性粒細胞白血?。籄BL蛋白；酪氨酸激酶；藥物篩選

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種起源于骨髓造血干細胞的血液系統(tǒng)惡性克隆疾病，約占成人白血病的20%左右。研究發(fā)現(xiàn)，大約有95%的CML患者中會出現(xiàn)Ph染色體。這個染色體的形成，是由于患者9號染色體上的abl(Abelson leukemia virus)基因與22號染色體上的bcr(breakpoint cluster region)基因相互易位形成融合基因bcr-abl，從而使abl原癌基因被激活[1]。ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性，但是在正常細胞中，其激酶活性是被嚴格調(diào)控的，而該融合過程可使ABL蛋白產(chǎn)生持續(xù)的酪氨酸激酶活性[2]。BCR-ABL融合蛋白在細胞信號轉(zhuǎn)導以及轉(zhuǎn)化過程中通過不斷磷酸化和活化下游底物，促使各階段粒細胞無限增殖和遷移，最終導致細胞生長失控，引發(fā)白血病[3-5]。

ABL蛋白是由幾個結構域共同組成的一個非受體型酪氨酸激酶，它包括N端結構域(NCap)、SH2結構域、SH3結構域、一段連接序列和C末端的激酶結構域，其中正是這段激酶結構域使得ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性[6-7]，因此，研究者們大都把目光集中在激酶結構域進行探討，以期能夠靶向治療慢性粒細胞白血病。

當前研究中較常用的ABL蛋白活性形式的表達方法是在昆蟲細胞或者其它真核細胞中進行[8]，盡管昆蟲細胞培養(yǎng)能夠提供大量蛋白，但它需要的時間成本和物力成本都較高，尤其是3～4周后容易產(chǎn)生突變體蛋白，所以穩(wěn)定性較差，重復性不好。本實驗選擇人源的c-ABL 1a酪氨酸激酶的64位～135位氨基酸序列作為靶點(能夠表達激酶結構域)，采用酪氨酸激酶和蛋白磷酸酶(PTP-1B)共表達的方法在原核系統(tǒng)中快速產(chǎn)出、表達和純化ABL酪氨酸激酶及其突變體蛋ABLT315I。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 基因abl購自上海捷瑞基因合成有限公司；引物和激酶底物由上海生工生物技術有限公司合成；載體pET-28a和和大腸桿菌感受態(tài)細胞均購于北京全式金生物技術有限公司，ptp-1b-pGEX-6p-1質(zhì)粒為實驗室所保存。Scientz-IID超聲波細胞破碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Superdex 200凝膠過濾層析柱購自GE公司；酶標儀購自Thermo fisher scientific。

1.2 目的基因的分子克隆及重組體的構建 選取abl基因的190位～1545位核苷酸序列作為目的基因，設計引物并由上海生工生物公司合成，進行PCR。上游引物序列：5′-GCGCATATGAACCTTTTCGTTGCACTGTATG-3′(Nde I酶切位點下劃線標識)下游引物序列：3′-CGGAATTCTCAGACGCC-TTGTTTCCCCAG-5′(EcoR I酶切位點下劃線標識)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收。將回收產(chǎn)物和pET-28a載體分別進行Nde I和EcoR I雙酶切后再連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α細胞中進行培養(yǎng)，篩選陽性克隆提取重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒送往北京奧科測序公司進行測序。

ABL蛋白的315位氨基酸T(蘇氨酸)突變?yōu)镮(異亮氨酸)，T的密碼子為ACU/ACC/ACA/ACG，I的密碼子為AUA/AUC/AUU，即相對應的核酸為944位核苷酸c突變?yōu)閠，即下列引物中加粗、加下劃線的位點。采用部分重疊引物設計的原理設計突變引物。以abl-pET 28a質(zhì)粒為模板，進行PCR。上游引物為：5′-GCCCCCGTTCTATATCATCATTGAGTTCATGAC-3′；下游引物為：3′-GTGGGCCCTCGGGGGCAAGATATAGTAGTA-5′。用DMT酶消化PCR產(chǎn)物，將DMT消化產(chǎn)物加入到DMT感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SOC平板中(含100 mg/L卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，并送往北京奧科測序公司進行測序。通過blast序列比對軟件，將測序結果和基因庫中的基因序列比對，觀察突變位點是否正確。

1.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 分別將質(zhì)粒pET28a-abl與pGEX6P-1-ptp-1b共同轉(zhuǎn)化進入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，將細胞涂布于含有50 μg/mL的卡那霉素和50 μg/mL的氨芐青霉素兩種抗性的LB平板上，于37 ℃溫箱中進行培養(yǎng)。

1.4 目的蛋白的表達與純化 取共轉(zhuǎn)化后LB平板上的陽性克隆接種于5 mL含有上述雙抗的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃，180 r/min培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后的菌液接種于400 mL含有上述雙抗的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃進行擴大培養(yǎng)，待菌液OD值達到0.4～0.6時，加入0.4 mM的IPTG于16 ℃誘導12 h，使目的蛋白得以大量表達。收集菌液進行離心(5000 r/min，30 min)，棄上清，將沉淀用蛋白緩沖液[10 mM咪唑，25 mMTris(pH8.0)，300 mM Nacl，20%甘油]進行重懸，超聲破碎細胞(4 ℃，功率為400 w，30 min)，懸液于4 ℃，15000 r/min離心30 min，收集上清液加入Ni2+親和柱中進行結合，結合了目的蛋白的親和柱用含有30 mM咪唑濃度的緩沖液沖洗，除去雜蛋白，接著用含有200 mM咪唑濃度的緩沖液將目的蛋白洗脫下來，通過Superdex 200凝膠過濾層析柱進一步純化蛋白。收集純化后的蛋白，通過10%的SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳檢測蛋白純度與相對分子量，然后采用BCA法測定蛋白濃度。該方法采用BSA標準蛋白進行濃度梯度稀釋，根據(jù)標準蛋白液濃度與光吸收值之間的關系繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線可以求出待測蛋白的濃度。

1.5 蛋白活性的測定 本實驗采用ATP/NADH偶聯(lián)的原理[9]測定蛋白激酶的活性：在ATP存在的情況下，酪氨酸多肽底物被ABL激酶磷酸化，同時，ATP轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP；ADP和PEP在PK的催化作用下，生成ATP和丙酮酸；丙酮酸和NADH在LDH的作用下，生成L-乳酸和NAD+。其中NADH被消耗減少。本實驗即是通過測定NADH在340 nm處的吸收值的變化，來間接測定激酶的活性。

用連續(xù)動力學法檢測激酶的活性，酶活反應體系所需的緩沖液：20 mM Tris(pH8.0)，50 mM NaCl，10 mM MgCl2，2 mM DTT。反應體系體積為100 μL，體系中各組分濃度為：180nM蛋白激酶，0.3 mM ATP，0.5 mM底物(底物肽段序列為：EAIYAAPFAKKK)，15 U/mL PK，15 U/mL LDH，0.5 mM NADH，2 mM PEP。體系中最后加入ATP起始反應。于酶標儀上340 nm波長處測定動力學反應曲線，每隔20s測1次OD值。

2 結果

2.1 PCR及基因測序結果 如圖1所示，經(jīng)過PCR后獲得了大量的目的基因(條帶位置約1356 bp)。并且經(jīng)測序，用blast序列比對軟件將測序結果與Genebank(NM_005157.5)中190～1545位核苷酸序列比對，abl基因與190～1545位基因序列完全一致(圖1a)，而突變型基因中只有944位核苷酸為t(圖中為第755位核苷酸)，與原序列(c)不一致(圖1b)，正是本實驗所需突變序列。

圖1 abl基因(a)和ablc944t突變基因(b)PCR及BLAST序列分析結果Fig.1 PCR and BLAST of abl gene(a) and ablc944t (b)mutant geneM: Gene marker; abl/ablc944t: target gene

圖2 ABL(a)及ABLT315I(b)凝膠過濾層析及Western blot分析；c：Superdex200層析柱標準樣品圖Fig.2 Gel filtration chromatography and Western blot of ABL(a) and ABLT315I(b);c: standard picture of Superdex200 chromatographic columnM:Protein marker;ABL/ABLT315I:Purified target protein

2.2 目的蛋白的純化及分析 圖2所示是ABL蛋白及ABLT315I突變體蛋白經(jīng)Superdex200凝膠過濾層析柱時的紫外吸收值(UV=280 nm)，從圖中可以看出，蛋白大約在14 mL開始出現(xiàn)峰值，根據(jù)superdex200層析柱的標準峰圖(2c)，在14 mL左右出現(xiàn)的蛋白，其分子量應該介于35000 Da和67000 Da之間，結合蛋白的分子量為51 kD，出峰位置與蛋白分子量相一致。收集圖中出峰位置的蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，2者的濃度分別為28 mg/L菌液和20 mg/L菌液。再經(jīng)SDS-PAGE分析，可以看到，膠片上除目的蛋白外，無明顯非目的蛋白條帶。

2.3 ABL蛋白激酶活性的測定 通過圖3可以看出，在上述酶活體系中，不加蛋白只加底物的情況下，NADH光吸收值沒有發(fā)生明顯變化；當加入蛋白而不加底物時，蛋白由于發(fā)生自磷酸化作用，NADH光吸收值有一定的下降；當ABL蛋白或ABLT315I蛋白和底物都加入到體系后，NADH光吸收值明顯下降；說明本實驗通過原核表達系統(tǒng)獲得的蛋白具有較好的酪氨酸激酶活性。

圖3 ABL(a)及ABLT315I(b)蛋白的酶活測定曲線Fig.3 The curve of ABL(a) and ABLT315I(b) tyrosine kinase activity

3 討論

ABL酪氨酸蛋白激酶作為細胞信號轉(zhuǎn)導過程中一個重要的因子，其與BCR融合形成的BCR-ABL融合蛋白在CML的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，以它作為靶點來進行研究，使靶向治療CML顯得非常有意義。

患者體內(nèi)ABL蛋白發(fā)生的一些突變使得CML的治療變得有些困難。目前已開發(fā)出一些基于ABL蛋白的抑制劑，包括伊馬替尼(imatinib)，尼洛替尼(nilotinib)，博舒替尼(bosutinib)等，均對ABL蛋白有很好的抑制作用，但由于蛋白一些位點的突變，使得部分患者產(chǎn)生耐受現(xiàn)象[10-12]。普納替尼(ponatinib)既對野生型BCR-ABL的活性有效，也能抑制T315I突變體的活性[13]，但存在嚴重的血栓和血管堵塞等危及生命的副作用。目前臨床上仍然沒有一個靶向性強，安全性高，且對所有蛋白突變體有效的藥物。

ABL蛋白的突變主要發(fā)生在幾個氨基酸位點，如Y253H，E255V、E255K，F(xiàn)359V，T315I，其中T315I突變是最經(jīng)常發(fā)生的[14-15]，而且是目前的藥物最難克服的突變。因此本實驗選擇野生型和T315I突變型蛋白作為靶點進行有關研究。

本實驗在沒有進行蛋白共表達之前，采用原核表達系統(tǒng)對ABL蛋白進行表達，結果發(fā)現(xiàn)，ABL酪氨酸蛋白激酶得到了大量表達(大約100 mg/L菌液)，但這些蛋白都是以包涵體的形式存在的。接著采用變性、復性的方法重新對包涵體進行溶解、純化，但是結果表明，最后得到的蛋白都是無活性的，不利于后期酶活體系的優(yōu)化及藥物的篩選。這種蛋白的低產(chǎn)出率可能是由于在原核表達系統(tǒng)中ABL蛋白激酶產(chǎn)生不可控的活性，導致其產(chǎn)生毒性。

為了增加有活性、可溶性蛋白的產(chǎn)物，本研究選擇ABL蛋白激酶與蛋白磷酸酶共表達的方法。之所以選擇PTP-1B磷酸酶，是因為該酶是一種特異性的酪氨酸磷酸酶，能夠在體內(nèi)抑制ABL蛋白的自磷酸化作用，并且增加蛋白的可溶性[16]。本實驗選擇能夠表達ABL蛋白激酶結構域的63～135位氨基酸序列進行研究，更能客觀地測定激酶的活性。在原核細胞中共表達后，通過蛋白純化，獲得了濃度和純度均比較高的蛋白?？梢杂糜诤罄m(xù)對蛋白進行晶體結構的研究。

通過表達和純化后得到的蛋白是沒有發(fā)生磷酸化的激酶，在ATP存在的情況下，蛋白激酶可以迅速發(fā)生自磷酸化和磷酸化底物。對激酶活性進行測定時，本研究采用ATP/NADH偶聯(lián)的方法間接測定蛋白的酪氨酸激酶活性。因為該方法已經(jīng)比較成熟，被很多研究者使用。這種方法屬于動力學法檢測酶的活力。通過測定，ABL蛋白以及ABLT315I突變體蛋白在酶活體系中均表現(xiàn)出較好的活性，說明通過該方法獲得的蛋白具有很好的酪氨酸激酶活性。

總之，本研究中選擇蛋白共表達的方法，在原核表達系統(tǒng)中獲得大量可溶性的ABL蛋白及ABLT315I突變體蛋白，并且蛋白的純度和活性均較好。相對于昆蟲細胞培養(yǎng)和其他原核表達系統(tǒng)的培養(yǎng)、純化方法，此方法成本低，重復性好，接下來，需要研究的是進一步優(yōu)化整個酶活體系，更利于進行對抑制劑的篩選工作。并且需要從晶體方面對蛋白和抑制劑的結構進行闡釋，使分子靶向治療CML的機理更加明確。

[1] Goldman JM.Chronic myeloid leukemia:a historical perspective[J].Semin Hematol,2010,47(4):302-311.

[2] Colicelli J.ABL tyrosine kinases:evolution of function,regulation,and specificity[J].Sci Signal,2010,3(139):re6.

[3] Hehlmann R,Hochhaus A,Baccarani M,et al.Chronic myeloid leukaemia[J].Lancet,2007,370(9584):342-350.

[4] Wong S,Witte ON.The BCR-ABL story:bench to bedside and back[J].Annu Rev Immunol,2004,22:247-306.

[5] Greuber EK,Smith-Pearson P,Wang J,et al.Role of ABL family kinases in cancer:from leukaemia to solid tumours[J].Nat Rev Cancer,2013,13(8):559-571.

[6] Dolker N,Gorna MW,Sutto L,et al.The SH2 Domain Regulates c-Abl Kinase Activation by a Cyclin-Like Mechanism and Remodulation of the Hinge Motion[J].PLOS Computational Biology,2014,10(10):e1003863.

[7] Gonfloni S.Defying c-Abl signaling circuits through small allosteric compounds[J].Frontiers in Genetics,2014,5:392.

[8] Aleem SU,Craddock BP,Miller WT.Constitutive Activity in an Ancestral Form of Abl Tyrosine Kinase[J].PLOS ONE,2015,10(6):e0131062.

[9] Lacob RE,Zhang J,Gray NS,et al.Allosteric Interactions between the Myristate-and ATP-Site of the Abl kinase[J].PLOS ONE,2011,6(1):e15929.

[10] An X,Tiwari AK,Sun Y,et al.BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors in the treatment of Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia:a review[J].Leukemia research,2010,34(10):1255-1268.

[11] Fava C,Rege-Cambrin G,Saglio G.The choice of first-line chronic myelogenous leukemia treatment[J].Ann Hematol,2015,94(Suppl 2):S123-S131.

[12] Golemovic M,Verstovsek S,Giles F,et al.AMN107,a novel aminopyrimidine inhibitor of Bcr-Abl,has in vitro activity against imatinib-resistant chronic myeloid leukemia[J].Clin Cancer Res,2005,11(13):4941-4947.

[13] O′hare T,Shakespeare W C,Zhu X,et al.AP24534,a pan-BCR-ABL inhibitor for chronic myeloid leukemia,potently inhibits the T315I mutant and overcomes mutation-based resistance [J].Cancer cell,2009,16 (5):401-412.

[14] Hantschel O,Superti-Furga G.Regulation of the c-Abl and Bcr-Abl tyrosine kinases[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5:33-44.

[15] Xianming D,Sang ML,Jianming Z,et al.Broad spectrum alkynyl inhibitors of T315I Bcr-Abl[J].Bioorg Med Chem Lett,2010,20(4):4196-4200.

[16] Chen S,Dumitrescu TP,Smithgall TE,et al.Abl N-terminal cap stabilization of SH3 domain dynamics[J].Biochemistry,2008,47(21):5795-5803.

(編校：譚玲)

Isolation, purification and activity identification of ABL tyrosine kinase and ABLT315Imutant

LIU Su-xiao, WANG You-pingΔ, CUI Lin, LIU Wei-hong, SHEN Si, XING Zuo-ying

(Central Lab, The First Affiliated Hospital of Henan University of TCM, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo establish a simple, stableand effective method for the isolation and purification of ABL tyrosine kinase and its mutant ABLT315I.MethodspET-28a vector was inserted inablgene or its site directed mutagenesis.Then Escherichia coli BL21 competent cells were co-transformed with pGEX6P-1-ptp-1b and pET28a-abl/pET28a-ablc944t.The transformed BL21 cells were incubated, and then were stimulated with Isopropyl-β-D-thiogala-ctopyranoside (IPTG) to express ABL tyrosine kinase and its mutant.The ABL tyrosine kinase and its mutant was purified by affinity chromatography and gel filtration chromatography.SDS-PAGE was used to detect the purity and relative molecular weight of ABL tyrosine kinase and its mutant.BCA method was used to determine the concentration of ABL tyrosine kinase and its mutant.Finally, kinase activity of target protein was examined by ATP/NADH coupling method.ResultsSDS-PAGE showed the high purity of ABL tyrosine kinase and its mutant.The concentration of ABL and ABLT315Iprotein was reached 28mg/L of LB and 20mg/L of LB, respectively.Both of the target protein was measured to have good tyrosine kinase activity in vitro.ConclusionA simple, stable and effective method for the isolation and purification of ABL tyrosine kinase and its mutant was found successfully in the study, which laying good foundation for High Throughput Drug Screening and structure analysis of protein subsequently.

chronic myelogenous leukemia; ABL protein; tyrosine kinase; drug screening

劉素曉，女，碩士，研究方向：藥理學、分子生物學，E-mail：:xiaosuliuami@163.com；王幼平，通訊作者，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：高血壓病的防治，E-mail:：wangyp8@163.com。

Q819

A

1005-1678(2015)08-0019-04