適配體在毒品毒物分析中的應(yīng)用

孫美琪，曹芳琦，胡小龍，張玉榮，陸鑫蔚，李茂盛，曾立波

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海200083）

鑒定綜述
R e v i e w

適配體在毒品毒物分析中的應(yīng)用

孫美琪1，2，曹芳琦3，胡小龍2，張玉榮2，陸鑫蔚2，李茂盛2，曾立波2

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海200083）

適配體是體外合成的能與蛋白質(zhì)、其他小分子物質(zhì)、有機(jī)離子等等各種配體特異結(jié)合單鏈DNA/RNA，是由SELEX（體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）技術(shù)篩選得到，適配體具有對靶標(biāo)的高特異性和親和性、合適的化學(xué)穩(wěn)定性、無免疫原性和毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。利用適配體的這些優(yōu)越性是得適配體可以作為生物識別分子元件應(yīng)用于傳感器及分析試紙中，進(jìn)而可以快速高效的檢測毒物毒品。為了大大提高辦案的效率，為維護(hù)法治、打擊犯罪提供更好的技術(shù)支持，通過介紹了一種基于適配體（aptamer）為識別元件的高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗(yàn)方法。

適配體；SELEX；毒品毒物；檢測

1 適配體

早在20世紀(jì)60年代，人們就提出核酸除了具有模板功能，還能折疊成復(fù)雜的三維形狀，表現(xiàn)出生物化學(xué)活性。含有約1015個(gè)核酸分子的隨機(jī)序列寡核苷酸庫可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，且可以用于平行篩選以獲得具有特定功能的，如高親和性的結(jié)合配體（適配體）或催化活性的核酸酶（核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶）。Tuerk等[1]在1990年提出了一種新的體外篩選和擴(kuò)增方法，命名為SELEX（指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化）。他們應(yīng)用一個(gè)組合核酸庫篩選RNA寡核苷酸，這些RNA寡核苷酸對非核酸靶標(biāo)（T4DNA聚合酶gp43）結(jié)合非常牢固并具有選擇性。同年，Ellington等[2]也用相似的篩選方法從隨機(jī)序列的RNA庫中分離出RNA分子，這些RNA分子能識別并結(jié)合小分子有機(jī)染料（汽巴克隆藍(lán)、活性藍(lán)4）。他們將這些篩選出的個(gè)別的RNA序列命名為aptamer（“適配體”），它源于拉丁文詞aptus，意思為“適合”。兩年后他們又從一個(gè)化學(xué)合成的隨機(jī)序列的DNA庫中成功篩選到單鏈DNA（ssDNA）適配體[3]。

適配體的功能是以其穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，其三維結(jié)構(gòu)取決于其一級序列、核苷酸分子的長度（少于100 nt）與環(huán)境條件。典型的結(jié)構(gòu)單元包括莖，內(nèi)環(huán)，凸環(huán)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，四角環(huán)，假結(jié)體，三重體，吻合復(fù)合物和G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在靶分子存在時(shí)，適配體通過自適應(yīng)的構(gòu)象變化和三維折疊形成特異性的靶分子結(jié)合位點(diǎn)。適配體和靶分子間的作用結(jié)合了形狀互補(bǔ)，芳香化合物間的堆積作用，適配體的堿基堆積作用，帶電基團(tuán)的靜電作用和氫鍵作用的特點(diǎn)[4-5]，這種對靶分子表現(xiàn)出高親和性結(jié)合和高特異性識別的適配體有時(shí)被形容為“化學(xué)抗體”，實(shí)際上它們表現(xiàn)出許多優(yōu)于抗體的優(yōu)點(diǎn)：（1）它們可以針對任何靶分子，包括毒性物質(zhì)，而且適配體分子比抗體?。?～15kDa），可以接近免疫球蛋白很難接近的區(qū)域。（2）它們?nèi)菀撞⑶铱芍貜?fù)合成，易于保存，具有化學(xué)穩(wěn)定性。（3）它們易于化學(xué)修飾和簡單的設(shè)計(jì)，進(jìn)而可方便與各種衍生物偶聯(lián)。因此，適配體成為開發(fā)分析方法的理想工具，在治療和診斷試劑、有效的生物傳感材料、有效的色譜、電泳[分離材料中扮演著重要的角色[6-11]。

在治療應(yīng)用方面，1990年首次報(bào)道了評價(jià)適配體作為病理性靶蛋白抑制劑的研究。這個(gè)突破性的研究證明由HIV進(jìn)化來的，一種利用病毒和細(xì)胞蛋白到病毒轉(zhuǎn)錄的TARRNA反過來能夠抑制該病毒的復(fù)制[12]。由tRNA啟動(dòng)子表達(dá)的TAR適配體序列作為病毒Tat和CD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞周期T1蛋白的誘餌寡核苷酸。表達(dá)高水平TAR適配體的細(xì)胞被證明它具有對病毒復(fù)制和細(xì)胞毒性的高度抗性[12-13]。這些結(jié)果描述了一種抑制HIV復(fù)制的新方法，第一次展示了RNA適配體能用作治療藥物，直接與臨床相關(guān)蛋白結(jié)合并抑制其活性。2004年是這個(gè)領(lǐng)域中具有里程碑的一年，美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)哌加他尼那（Macugen）上市。第一個(gè)被批準(zhǔn)的具有治療功能的適配體是人-VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）的適配體。這種適配體的聚乙二醇化的形式叫做哌加他尼，是新近開發(fā)的治療濕性老年性黃斑變性的藥物活性成分。抗血管上皮因子的適配體藥物（pegaptnib）已被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)，用于治療新生血管老年性黃斑變性[14]。

除了治療市場，適配體也應(yīng)用在新的分析系統(tǒng)和檢測方法的開發(fā)（例如，生物分析、醫(yī)學(xué)診斷，也包括環(huán)境分析）。比如將適配體引入分析器件，作為一種分子識別工具用在液相色譜、電色譜以及毛細(xì)管電泳等分離檢測方法中[15-18]，可以將兩者的優(yōu)勢結(jié)合起來，是非常有效的分析手段。適配體的“靶分子廣、容易合成、具有核酸的性質(zhì)”等特點(diǎn)，可以拓寬待測物范圍、降低成本、減少非特異性吸附。同時(shí)，適配體的高親和力保證了分離效果和選擇性。適配體也可結(jié)合納米等材料用于各種不同的生物分析檢測，這種功能化的適配體納米的使用即可在溶液相中進(jìn)行也可在固相中進(jìn)行，作為捕獲和信號放大工具的方法[19]，可在食品安全分析領(lǐng)域內(nèi)對生物毒素、重金屬離子、農(nóng)藥殘留等食品中的危害因子進(jìn)行高靈敏、高特異性的快速檢測。

除此之外，治療和生物醫(yī)學(xué)用的適配體的發(fā)展正在一個(gè)廣泛的前沿領(lǐng)域推進(jìn)[20-21]，而且適配體的醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究在腫瘤影像和治療[22-23]，流感病毒的檢測和抑制以及一般的臨床診斷方面更超前[24-26]?？梢灶A(yù)計(jì)在不久的將來，大量的適配體將會(huì)發(fā)展成為藥物和分析診斷工具。

2 SELEX篩選技術(shù)原理

SELEX過程具有體外篩選和酶擴(kuò)增的迭代循環(huán)特點(diǎn)，對于一個(gè)給定問題的解決，其模擬達(dá)爾文式進(jìn)化的過程驅(qū)使篩選向相對少的，但最優(yōu)化的結(jié)構(gòu)靠近[27]。整個(gè)過程是連續(xù)的重復(fù)步驟，包括篩選（結(jié)合、分離、洗脫），擴(kuò)增和調(diào)節(jié)（圖1）。整個(gè)過程開始于一個(gè)隨機(jī)的單鏈寡核苷酸庫，該庫通常含有約1015~ 1016個(gè)單鏈核酸，該核酸序列的5’和3’端都帶有一端固定的序列，在PCR過程中行使引物結(jié)合位點(diǎn)的功能，中間為隨機(jī)合成的序列。這種庫的中間隨機(jī)序列區(qū)一般包含有20~80 nt，兩端的引物位點(diǎn)分別為18~21 nt。對于DNA適配體的篩選，這個(gè)庫可以直接用于SELEX過程的第一輪篩選。對于RNA適配體的篩選，在開始SELEX篩選之前，必須將DNA庫轉(zhuǎn)錄為RNA庫。在第一輪SELEX篩選中，復(fù)雜的RNA或DNA庫與靶分子混合孵育，隨后通過嚴(yán)格的沖洗步驟，使形成的結(jié)合復(fù)合物與未結(jié)合的和弱結(jié)合的寡核苷酸分離。這是關(guān)鍵的步驟之一，對篩選的適配體的結(jié)合特性有極大影響。結(jié)合靶分子的寡核苷酸被洗脫，并通過PCR或RT-PCR擴(kuò)增，通過純化相關(guān)的單鏈DNA或者通過體外轉(zhuǎn)錄和純化合成的RNA，使形成的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為一個(gè)新的寡核苷酸庫。這個(gè)新篩選出的富集的寡核苷酸庫在下一輪SELEX循環(huán)中再次用于與靶分子的結(jié)合反應(yīng)，通過篩選和擴(kuò)增的迭代循環(huán)，最初的隨機(jī)寡核苷酸庫減少為相對較少的、對靶分子具有最高親和性和特異性的基元序列。一般來說，適配體篩選需要6~20輪SELEX循環(huán)。

圖1 SELEX篩選過程圖

3 適配體在毒品毒物分析中的應(yīng)用

自20世紀(jì)80年代世界毒品毒物犯罪活動(dòng)日益猖獗起，有關(guān)于毒品檢測問題就迫切需要解決。而國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道關(guān)于毒品毒物的多種檢測方法，多是需要依賴一些價(jià)格昂貴的檢測儀，這就限制了毒品毒物犯罪案件的現(xiàn)場快速檢驗(yàn)。

張強(qiáng)等[28]將體外合成的ssDNA文庫固相化于瓊脂糖凝膠顆粒表面，液相中甲胺磷與其結(jié)合的DNA分子從固相表面分離，進(jìn)而建立了非固相化SELEX技術(shù)。10輪篩選后，經(jīng)熒光法檢測，篩選效率達(dá)到62.1%，并最終獲得了5條針對甲胺磷的核酸適體。

Handy等[29]首次篩選出一種小分子海洋生物毒素——蛤蚌毒素（STX）的核酸適體。STX經(jīng)過化學(xué)修飾與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)形成STX-Jeffamine-KLH復(fù)合物，再將其固定在環(huán)氧基化磁珠表面，經(jīng)過10輪篩選（其中4～10輪用Jeffamine-KLH反篩）獲得特異性識別STX的核酸適體。選取其中一條適體APTSTX1用SPR檢測，有良好的結(jié)合率且無交叉反應(yīng)。

Anniron[30]在1997年報(bào)道了RNA適體檢測多巴胺的檢出限達(dá)到2.8 umol/L。

陸鑫蔚等[31]也利用SELEX技術(shù)成功篩選出可以特異性識別甲基苯丙胺的適配體，后期可以進(jìn)一步做成作為生物分子識別元件應(yīng)用于試劑盒或生物傳感器形式，攜帶方便，用于刑事案發(fā)現(xiàn)場，便于快速檢測。

Baker等[32]建立了電化學(xué)傳感器平臺來檢測可卡因。將亞甲基藍(lán)連接到適配體的一端，適配體通過另一端固定在電極表面，且適配體作為檢測適配體-結(jié)合反應(yīng)的氧化還原探針。靶分子不存在時(shí)，認(rèn)為適配體部分保持展開結(jié)構(gòu)，在氧化還原探針與電極表面間有較大的距離。靶分子存在時(shí)，適配體可能折疊成結(jié)合位點(diǎn)，探針和電極表面的距離減小，改變了電子傳遞，增加了可測的亞甲基藍(lán)的還原峰。

Li[33]成功的分離了可卡因和其類似物愛康寧。他們將靶分子本身作為信號探針，發(fā)展了一系列基于適配體-CE技術(shù)的分析方法?？煽ㄒ蚣捌漕愃莆飷劭祵幵诜肿咏Y(jié)構(gòu)中都含叔胺基團(tuán)，因此都能夠作為三聯(lián)吡啶釕的共反應(yīng)物，在鉑電極上產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。所以兩種物質(zhì)的混合樣品經(jīng)過CE分離，會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)ECL峰，如果樣品中含有一定量的可卡因適配體，可卡因與適配體復(fù)合物的形成，使游離的可卡因的數(shù)目減少，復(fù)合物和游離的可卡因在毛細(xì)管中會(huì)被分離，可卡因自身的峰降低。與此同時(shí)，愛康寧不與適配體作用，它的峰不會(huì)變，所以通過可卡因的峰降低可直接實(shí)現(xiàn)對可卡因的選擇性識別和定量檢測，檢測限為2umol/L。

liu[34]基于帶有測流技術(shù)的試紙樣平臺對可卡因進(jìn)行檢測，使用先前報(bào)道的腺苷和可卡因的適配體開發(fā)了這種新的適配體試紙[35]，可卡因檢測也應(yīng)用在人血清樣品中。這種分析形式大多是用于抗體的受體，但是抗體穩(wěn)定性差、不能在常溫貯藏下長期保持生物活性問題，而適配體在高溫或不良環(huán)境下非常穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)，可用來替代抗體[1，36]。這種試紙經(jīng)過后期改進(jìn)做成快速檢測試劑盒，可以達(dá)到對可卡因的犯罪現(xiàn)場快速檢測。適配體對靶標(biāo)的高特異性和親和性使得以適配體為識別分子的高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗(yàn)方法必能為維護(hù)法制、打擊犯罪提供更好的技術(shù)支持。

此外，本課題也初步篩選出能夠識別氯胺酮的適配體，并對該適配體的特異性、親和性進(jìn)行表征，證明了該適配體不會(huì)與美沙酮、美沙芬發(fā)生交叉反應(yīng)，進(jìn)一步可以將該適配體作為識別分子研制成試劑盒，可以達(dá)到現(xiàn)場快速檢測的目的，同時(shí)，也避免了交叉反應(yīng)提高了準(zhǔn)確性。

4 展望

核酸適配體作為一種人工合成的核酸，具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和高特異性、高親和力、便于化學(xué)修飾與功能化等特點(diǎn)，且易于進(jìn)行大量低成本的可重復(fù)性合成。無機(jī)離子、有機(jī)分子、生物大分子蛋白質(zhì)、酶、受體等乃至細(xì)胞、微生物均可能存在與其相對應(yīng)的高特異性親和配體。核酸適配體的篩選過程，不依賴于生物體，并且適配體的篩選過程無需在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，可以篩選出沒有免疫原性或低免疫原性，甚至具有毒性的靶物質(zhì)的核酸適配體。除此之外，這些核酸適配體的末端易于修飾上各種活性基團(tuán)如：氨基，磷酸基，巰基，熒光標(biāo)記物，電化學(xué)標(biāo)記物等，用于表面固定修飾或者檢測。基于這些優(yōu)點(diǎn)，適配體在醫(yī)療診斷、治療手段、新藥物的開發(fā)、藥物輸送系統(tǒng)、生物影像、分析試劑、毒品毒物檢測、食品安全分析等領(lǐng)域扮演著重要的角色。然而，核酸適體技術(shù)在毒品毒物分析領(lǐng)域的應(yīng)用才剛剛起步，有很多可深入開發(fā)和研究的內(nèi)容，總結(jié)起來主要有以下兩個(gè)方面。

首先，針對特異性識別小分子毒品毒物的核酸適配體的篩選。SELEX過程起始于一個(gè)隨機(jī)的含有約1 015~1 016個(gè)單鏈寡核苷酸庫，該庫中間為隨機(jī)序列，兩端為引物結(jié)合為點(diǎn)。這個(gè)庫是否是真正的隨機(jī)是整個(gè)適配體篩選過程的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。序列隨機(jī)性發(fā)生一點(diǎn)偏離，就可能導(dǎo)致序列空間的歪曲，反過來就限制了能夠和靶分子高特異性結(jié)合的適配體的捕獲。因此，寡核苷酸庫的質(zhì)量尤其重要。適配體篩選過程中寡核苷酸分離的常用方法是通過過濾或磁珠捕集或親和柱捕集，必須先將靶分子固定于分離膜、磁珠或親和柱上，而很多毒品毒物為小分子物質(zhì)，需要對其構(gòu)建活性基團(tuán)才能固定于分離基質(zhì)上。然而，這種對小分子的改性是否會(huì)掩蓋活性位點(diǎn)，是否會(huì)造成非特異性吸附等問題仍需要更深的研究。

其次，適配體作為生物識別分子引入毒品毒物快速檢測方法的開發(fā)中。眾所周知，在案發(fā)現(xiàn)場快速準(zhǔn)確檢測毒品毒物，能大大提高辦案的效率。適配體對于靶分子具有高度的特異性和親和性，以及超越抗體的優(yōu)越性使得適配體可以作為生物識別分子元件應(yīng)用于傳感器及分析試紙。但是，核酸適配體分子的優(yōu)化條件、靈敏度的提高方法仍需探討。隨著研究的深入，適配體作為一種新的識別元素會(huì)產(chǎn)生高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗(yàn)方法，從而為維護(hù)法制、打擊犯罪提供更好的技術(shù)支持，在毒品毒物檢測中展現(xiàn)魅力。

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（本文編輯：卓先義）

App lication of Aptam ers in Forensic Toxicology

SUNMei-qi1,2,CAO Fang-qi3,HU Xiao-long2,ZHANG Yu-rong2,LU Xin-wei2,LIMao-sheng2,ZENG Li-bo2
(1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Technology,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai200437,China;2.Shanghai Key Laboratory of Criminal Scene Evidence,Institute of Forensic Science, Shanghai Public Security Bureau,Shanghai200083,China;3.Institute of Criminal Science and Technology, Shanghai Public Security Bureau,Shanghai200083,China)

Aptamers are synthetic single stranded RNA or DNA molecules capable of specifically binding to other target molecules.Aptamers are commonly performed by the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) process.They are of high specificity and affinity to targets,chemical stable,non-immunogenic and have no side effects.With these advantages,aptamers can be applied in sensors and strips as recognition entities to achieve the rapid detection of drugs and toxicants.A highly sensitive,specific and rapid method based on aptamers for the detection of drugs and toxicants is introduced in this paper.

aptamer;SELEX;drug and toxicant;detection

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.014

1671-2072-（2015）02-0075-05

2014-07-16

上海市科委項(xiàng)目（12231202800）

孫美琪（1987—），女，碩士研究生，主要從事毒物分析與分子免疫學(xué)研究，Email：mqsun1216@163.com。

曾立波（1954—），男，研究員，主任法醫(yī)師，一級法醫(yī)官，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)研究和法醫(yī)毒物、毒品分析研究。E-mail：merry.magin@163.com。